Начните с повторного суспендирования лиофилизированного пептида MOG 35 55 в воде. Разбавьте пептидный запас до 10 мкг на миллилитр в буфере для покрытия перед экспериментом. Теперь пипеткой нанесите 100 микролитров готового раствора в лунки на 96 лунок планшета.
Одновременно покройте равное количество лунок 100 микролитрами БСА, растворенными в буфере покрытия. Запечатайте пластину клейкой пленкой, чтобы предотвратить испарение, и выдержите пластину в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день выполните три промывки тарелки с 200 микролитрами PBS с добавлением 0,5%tween 20.
Затем добавьте 100 микролитров на лунку блокирующего раствора, состоящего из 3% BSA в PBS. Инкубируйте герметичную пластину в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия в гибридизационной печи. После инкубации трижды вымойте пластину по 200 микролитров на лунку PBST.
Разведите каждый образец сыворотки, полученный из крови иммунизированных мышей EAE, в блокирующем растворе и добавьте по 100 микролитров на лунку в лунки с покрытием MOG 35, 55 и BSA. Добавьте такой же объем блокирующего раствора в назначенные глухие скважины. Выдержать герметичную тарелку в течение двух часов при комнатной температуре при постоянном встряхивании.
После инкубации извлеките пластину из инкубатора и трижды промойте пластину по 200 микролитров на лунку PBST. Разведите конъюгированное HRP вторичное антитело в растворе, содержащем 0,2% БСА в PBST и добавьте по 100 микролитров в каждую лунку. Инкубируйте герметичную тарелку в течение одного часа при комнатной температуре, поддерживая постоянное встряхивание.
Вымойте тарелку три раза по 200 микролитров на лунку PBST. Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров трех, трех праймовых, пяти, пяти прайм-тетраметилбензидинового субстрата. Инкубируйте в темноте от одной до пяти минут, наблюдая за развитием синего цвета.
Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров стоп-раствора. Затем используйте планшетный считыватель, установленный на длине волны 450 нанометров, чтобы измерить оптическую плотность в каждой лунке. Значения оптической плотности образцов EAE были значительно выше, чем в контрольных образцах, что указывает на устойчивый ответ иммуноглобулина G против пептида MOG.
