culturing h9-embryonic stem cells for generation of human neural retina

Verbesserte 3D-Differenzierung der neuronalen Netzhaut von menschlichen embryonalen Stammzellen

The eye serves as the primary source of information among human sensory organs, with the retina being the principal visual sensory tissue in mammalian eyes1. Retinopathy stands as one of the primary global causes of eye diseases, leading to blindness2. Approximately 2.85 million people worldwide suffer from varying degrees of vision impairment due to retinopathy3. Consequently, investigating its pathogenesis is crucial for early diagnosis and timely treatment. Most studies on human retinopathy have primarily focused on animal models4,5,6. However, the human retina is a complex, multi-layered tissue comprising various cell types. Traditional two-dimensional (2D) cell culture and animal model systems typically fail to faithfully recapitulate the normal spatiotemporal development and drug metabolism of the native human retina7,8.
Recently, 3D culture techniques have evolved to generate tissue-like organs from pluripotent stem cells (PSCs)9,10. Retinal organoids (ROs) generated from human PSCs in a 3D suspension culture system not only contain seven retinal cell types but also exhibit a distinct stratified structure similar to the human retina in vivo11,12,13. Human PSC-derived ROs have gained popularity and widespread availability and are currently the best in vitro models for studying the development and disease of the human retina14,15. Over the past few decades, numerous researchers have demonstrated that human PSCs, including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), can differentiate into ROs using various induction protocols. These advancements hold enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies16,17,18.
However, the generation of neural retina (NR) from human pluripotent stem cells (PSCs) is a complex, cumbersome, and time-consuming process. Furthermore, batch-to-batch variations in tissue organoids may lead to lower reproducibility of results19,20. Numerous intrinsic and extrinsic factors can influence the yield of retinal organoids (ROs), such as the number or species of starting cells and the use of transcription factors and small-molecule compounds21,22,23. Since the first human RO was generated by the Sasai laboratory11, multiple modifications have been proposed over the years to enhance the ease and effectiveness of the induction process13,21,24,25. Unfortunately, to date, no gold standard protocol has been established for generating ROs in all laboratories. Indeed, there is a certain degree of discrepancy in ROs resulting from different induction methods, as well as wide variation in the expression of retinal markers and the robustness of their structure22,26. These issues may severely complicate sample collection and the interpretation of study findings. Therefore, a more consolidated and robust differentiation protocol is needed to maximize efficiency with minimal heterogeneity of RO generation.
This study describes an optimized induction protocol based on a combination of Kuwahara et al.12 and D&#246;pper et al.27 with detailed instructions. The new method significantly reduces the probability of organoid vesiculation and fusion, increasing the success rate of generating NR. This development holds great promise for disease modeling, drug screening, and cell therapy applications for retinal disorders.

Autor im Rampenlicht: Einfache und effiziente Produktion von neuronalen Netzhaut-Organoiden für die Modellierung von Krankheiten

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Our group focuses on understanding the pathogenesis and the treatment of human retinal diseases. Our protocol describes a optimized induction technique to generate a neural retina that significantly reduce the probability of vasculation and fusion to increase the success rate of retinal production until day 60. The modified method is simpler and more efficient in generating neural retina, which can prove to be a better disease model for drug screening and cell therapy.In the future, we aim to study the effects of physicochemical factors on retinal development and underlying mechanism using our retinal organoid model.

Kultivierung von H9-embryonalen Stammzellen zur Erzeugung menschlicher neuronaler Netzhaut 

Geben Sie zunächst einen Milliliter 1% extrazelluläre Matrix in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre. Nach einer Stunde zwei Milliliter vorwarmes Erhaltungsmedium mit 0,4 mikromolaren Y-27632 in jede Vertiefung geben.Um die embryonalen H9-Stammzellen aufzutauen, schütteln Sie den Kryoröhrchenfond in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Sekunden. Sterilisieren Sie das Kryofläschchen vorsichtig mit einem 75%igen Desinfektionsalkoholspray. Übertragen Sie dann die aufgetauten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das das Erhaltungsmedium und Y-27632 enthält.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 190 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann vorsichtig den größten Teil des Überstands und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Erhaltungsmedium, das Y-27632 enthält. Geben Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der mit extrazellulärer Matrix beschichteten Platte, die das Erhaltungsmedium enthält.Schütteln Sie die Platte seitlich und inkubieren Sie die Platte mindestens 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium jeden Tag. Sobald die Klondichte 70% erreicht hatEntfernen Sie das verbrauchte Medium.Inkubieren Sie die Zellen nach 2D-PBS-Waschungen vier bis sieben Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Milliliter EDTA und entsorgen Sie EDTA vollständig. Geben Sie einen Milliliter Erhaltungsmedium in die Zellen und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte. Übertragen Sie dann die gelösten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie sie drei- bis fünfmal.Geben Sie 20 bis 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer zuvor zubereiteten ECM-beschichteten Schale und mischen Sie sie gut. Bestätigen Sie mit einem Mikroskop die Zelldichte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing H9-Embryonic Stem Cells for Generation of Human Neural Retina

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Inducing 3D Neural Retina Formation from Cultured H9-Embryonic Stem Cells for Stem-Cell Based Therapies

Induktion der 3D-Neuralnetzhautbildung aus kultivierten H9-embryonalen Stammzellen für stammzellbasierte Therapien