poly a tail length measurement of genes from drosophila brain

تحديد طول بولي (أ) للجينات من الجهاز العصبي ذبابة الفاكهة

Most eukaryotic mRNAs are posttranscriptionally polyadenylated at their 3&#8242; terminus in the nucleus by the addition of non-templated adenosines by canonical poly(A) polymerases. An intact poly(A) tail is pivotal throughout the lifecycle of mRNA, as it is essential for mRNA nuclear export1, facilitates interaction with poly(A)-binding proteins to enhance translational efficiency2, and imparts resistance against degradation3. In certain cases, the poly(A) tail can also undergo extension in the cytoplasm, facilitated by noncanonical poly(A) polymerases4. In the cytoplasm, poly (A) tail length dynamically changes and influences the life span of the mRNA molecule. Numerous polymerases and deadenylases are known for modulating tail length5,6,7. For example, the shortening of poly(A) tails correlates with translational repression, whereas the lengthening of poly(A) tails enhances translation8,9.
Accumulating genomic studies have demonstrated the fundamental significance of the poly(A) tail length across various facets of eukaryotic biology. This includes roles in germ-cell development, early embryonic development, neuronal synaptic plasticity for learning and memory, and the inflammatory response10. There have been numerous methods and assays developed for measuring poly(A) tail lengths. For example, the RNase H/oligo(dT) assay takes advantage of RNase H in the presence or absence of oligo(dT) to study poly(A) tail length11,12. Other methods to study poly(A) tail include the PCR amplification of 3&#39; ends such as rapid amplification of cDNA ends poly(A) test (RACE-PAT)12,13 and the ligase-mediated poly(A) test (LM-PAT)14. Further modifications of the PAT assay include ePAT15 and sPAT16. Enzymatic G-tailing17,18 or G/I-tailing&#160;of the 3&#39; end are other variations of the PAT assay. Further modification of these techniques includes the use of fluorescently labeled primers along with capillary gel electrophoresis for high-resolution analysis, referred to as the high-resolution poly(A) test (Hire-PAT)19. These PCR-driven assays allow fast and high-sensitivity poly(A) length quantitation.
With the development of next-generation sequencing, a high-throughput sequencing method, such as PAL-seq20 and TAIL-seq21, allows polyadenylation analyses at a transcriptome-wide scale. However, these methods provide only short sequencing reads of 36-51 nucleotides. Therefore, FLAM-Seq22 was developed for global tail length profiling of full-length mRNA and provides long reads. Nanopore technology23 provides PCR-independent, direct RNA, or direct cDNA sequencing for poly(A) tail length estimations. However, these high-throughput methods are not without limitations. They require large amounts of starting materials, are expensive, and time-consuming. Moreover, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with high-throughput methods, and low-throughput PCR-based methods still provide an advantage when a small number of transcripts need to be analyzed, for pilot experiments, and validation of other methods.
We have recently demonstrated that Dscam1 mRNAs contain short poly(A) tails in Drosophila, which necessitates a non-canonical binding of the cytoplasmic poly(A)-binding protein on Dscam1 3&#39;UTR using the G/I tailing method24. Here we provide a streamlined procedure for tissue preparation and quantifying poly(A) length of mRNAs from the Drosophila nervous system and Drosophila S2 cells.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف حدود أبحاث mRNA باستخدام تقنيات تحليل ذيل Poly A

قياس طول ذيل بولي أ من دماغ يرقة ذبابة الفاكهة وخط الخلية

Polyadenylation is a post-transcription modification. This add poly-A tails to the three-prime end of mRNA molecules. Dysregulation of polyadenylation has been associated with abnormal gene expression and various diseases, including neurological disorders.Our method provides a cost-effective, high-resolution analysis for measuring poly-A lengths. High-throughput methods for poly-A tail analysis, like next generation sequencing, and a high-throughput sequencing provides high-content information. However, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with these methods.PCR-based methods are usually low-throughput. However, they can be easily used to analyze a small number of transcripts. The GI-tailing method is one of them.With this method, we discovered that Dscam mRNAs contain short poly-A tails. Dscam is a neuronal cell adhesion molecule. It is involved in many important neurodevelopmental processes.Because Dscam mRNA contains short poly-A tails unlike most mRNAs, Dscam mRNA translation is under unique gene regulation, which is one of the questions we are trying to answer.

بولي أ قياس طول الذيل للجينات من ذبابة الفاكهة الدماغ

لبدء مخلفات G / I ، قم بإعداد خليط سعة 20 ميكرولتر على الجليد مع إجمالي الحمض النووي الريبي ومزيج عازلة الذيل ومزيج إنزيم الذيل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في دورة حرارية. ثم أضيفي محلول توقف الذيل واتركيه على الثلج لمدة دقيقتين.إجراء النسخ العكسي وتضخيم PCR. بعد الرحلان الكهربائي للهلام عالي الدقة لمنتجات PCR ، يمكنك الوصول إلى البيانات باستخدام البرنامج. افتح ملف XAD وحدد أسماء النماذج أو السلم في لوحة عرض الشجرة.قم بتكبير وتصغير مخططات الكهرباء والصور الشبيهة بالهلام للحصول على عرض مفصل. للحصول على أحجام الذروة ، افتح مخطط كهربية العينة المحددة. انقر بزر الماوس الأيمن على مخطط كهربية الفيروجرام وحدد التكامل اليدوي لتحديد القمم يدويا عن طريق سحب الخط الأفقي.لاحظ قيم الذروة في جدول الذروة وحدد القمة ذات الارتفاع الأكبر. قم بتمكين أيقونة إظهار / إخفاء نقاط التعيين في القائمة العلوية. ستظهر لوحة جديدة على الجانب الأيمن.حدد خيارات متقدمة ، وقم بالتمرير لأسفل إلى إجراء تحليل اللطاخة وحدد خانة الاختيار. سيؤدي هذا إلى إضافة جدول المنطقة إلى علامة التبويب مخطط كهربية الفيروجرام. ثم حدد مخطط كهربية وانتقل إلى جدول المنطقة.في قائمة من الزوج الأساسي وإلى الزوج الأساسي ، قم بتعيين زوج البداية والنهاية الأساسي بالنقر بزر الماوس الأيمن على مخطط كهربية الفيروجرام وتحديد منطقة لإضافتها. انقر بزر الماوس الأيمن فوق أي خلية في جدول المنطقة وحدد تعديل المناطق لإنشاء نافذة منبثقة جديدة صغيرة لتعيين مناطق مخصصة. استخدم هذه المعادلة لحساب طول ذيل poly(A) على mRNA محل الاهتمام.بعد ذلك في علامة التبويب مخطط كهربية ، تحقق إظهار الأحجام لتحويل جدول المنطقة تلقائيا من الزوج الأساسي إلى وقت التشغيل. افتح ملف CSV وحدد القيم التي تم الحصول عليها لوقت التشغيل لإنشاء رسم بياني. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحليل أطوال ذيل poly (A) لجينات Dscam1 و GAPDH من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة بينما أظهرت منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من أزواج أولية خاصة بالجينات نطاقا واحدا.أظهرت منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من أزواج التمهيدي العالمية الخاصة بالجينات أنماطا مميزة من اللطاخة ، مما يشير إلى الطول التفاضلي poly (A) ل mRNAs. تم الحصول على متوسط أطوال ذيل بولي (A) باستخدام تحليل اللطاخة. وتم تمثيل نطاق أطوال الذيل بواسطة الفيروجرامات.وبالمثل ، أظهر تحليل طول الذيل poly (A) على خلايا S2 أطوال ذيل poly (A) التفاضلية لجينات SV43 Prime UTR و GAPDH.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

Isolation of Brain from Drosophila Larvae and Harvest of S2 Schneider Cells

عزل الدماغ عن يرقات ذبابة الفاكهة وحصاد خلايا شنايدر S2

Total RNA Extraction from Drosophila Larvae Brain and S2 Schneider Cells

استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من دماغ يرقات ذبابة الفاكهة وخلايا شنايدر S2