poly a tail length measurement of genes from drosophila brain

Kwantificering van de Poly(A)-lengte van genen uit het Drosophila-zenuwstelsel

Most eukaryotic mRNAs are posttranscriptionally polyadenylated at their 3&#8242; terminus in the nucleus by the addition of non-templated adenosines by canonical poly(A) polymerases. An intact poly(A) tail is pivotal throughout the lifecycle of mRNA, as it is essential for mRNA nuclear export1, facilitates interaction with poly(A)-binding proteins to enhance translational efficiency2, and imparts resistance against degradation3. In certain cases, the poly(A) tail can also undergo extension in the cytoplasm, facilitated by noncanonical poly(A) polymerases4. In the cytoplasm, poly (A) tail length dynamically changes and influences the life span of the mRNA molecule. Numerous polymerases and deadenylases are known for modulating tail length5,6,7. For example, the shortening of poly(A) tails correlates with translational repression, whereas the lengthening of poly(A) tails enhances translation8,9.
Accumulating genomic studies have demonstrated the fundamental significance of the poly(A) tail length across various facets of eukaryotic biology. This includes roles in germ-cell development, early embryonic development, neuronal synaptic plasticity for learning and memory, and the inflammatory response10. There have been numerous methods and assays developed for measuring poly(A) tail lengths. For example, the RNase H/oligo(dT) assay takes advantage of RNase H in the presence or absence of oligo(dT) to study poly(A) tail length11,12. Other methods to study poly(A) tail include the PCR amplification of 3&#39; ends such as rapid amplification of cDNA ends poly(A) test (RACE-PAT)12,13 and the ligase-mediated poly(A) test (LM-PAT)14. Further modifications of the PAT assay include ePAT15 and sPAT16. Enzymatic G-tailing17,18 or G/I-tailing&#160;of the 3&#39; end are other variations of the PAT assay. Further modification of these techniques includes the use of fluorescently labeled primers along with capillary gel electrophoresis for high-resolution analysis, referred to as the high-resolution poly(A) test (Hire-PAT)19. These PCR-driven assays allow fast and high-sensitivity poly(A) length quantitation.
With the development of next-generation sequencing, a high-throughput sequencing method, such as PAL-seq20 and TAIL-seq21, allows polyadenylation analyses at a transcriptome-wide scale. However, these methods provide only short sequencing reads of 36-51 nucleotides. Therefore, FLAM-Seq22 was developed for global tail length profiling of full-length mRNA and provides long reads. Nanopore technology23 provides PCR-independent, direct RNA, or direct cDNA sequencing for poly(A) tail length estimations. However, these high-throughput methods are not without limitations. They require large amounts of starting materials, are expensive, and time-consuming. Moreover, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with high-throughput methods, and low-throughput PCR-based methods still provide an advantage when a small number of transcripts need to be analyzed, for pilot experiments, and validation of other methods.
We have recently demonstrated that Dscam1 mRNAs contain short poly(A) tails in Drosophila, which necessitates a non-canonical binding of the cytoplasmic poly(A)-binding protein on Dscam1 3&#39;UTR using the G/I tailing method24. Here we provide a streamlined procedure for tissue preparation and quantifying poly(A) length of mRNAs from the Drosophila nervous system and Drosophila S2 cells.

Auteur in de schijnwerpers: de grens van mRNA-onderzoek verkennen met Poly A Tail-analysetechnieken

Meting van Poly A-staartlengte van Drosophila-larvehersenen en cellijn

Polyadenylation is a post-transcription modification. This add poly-A tails to the three-prime end of mRNA molecules. Dysregulation of polyadenylation has been associated with abnormal gene expression and various diseases, including neurological disorders.Our method provides a cost-effective, high-resolution analysis for measuring poly-A lengths. High-throughput methods for poly-A tail analysis, like next generation sequencing, and a high-throughput sequencing provides high-content information. However, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with these methods.PCR-based methods are usually low-throughput. However, they can be easily used to analyze a small number of transcripts. The GI-tailing method is one of them.With this method, we discovered that Dscam mRNAs contain short poly-A tails. Dscam is a neuronal cell adhesion molecule. It is involved in many important neurodevelopmental processes.Because Dscam mRNA contains short poly-A tails unlike most mRNAs, Dscam mRNA translation is under unique gene regulation, which is one of the questions we are trying to answer.

Poly A staartlengtemeting van genen uit Drosophila Brain

Om te beginnen met G/I-tailing, bereidt u een mengsel van 20 microliter op ijs met totaal RNA, staartbuffermix en staartenzymmix. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 60 minuten in een thermocycler. Voeg vervolgens de staartstopoplossing toe en laat deze twee minuten op ijs staan.Voer reverse transcriptie en PCR-amplificatie uit. Na gelelektroforese met hoge resolutie van PCR-producten, krijgt u toegang tot gegevens met behulp van de software. Open het XAD-bestand en selecteer voorbeeldnamen of ladder in het deelvenster Boomstructuur.Zoom in en uit op elektroferogrammen en gelachtige afbeeldingen voor een gedetailleerde weergave. Om de piekmaten te verkrijgen, opent u het elektroferogram van een geselecteerd monster. Klik met de rechtermuisknop op het elektroferogram en selecteer handmatige integratie om handmatig pieken te selecteren door de horizontale lijn te slepen.Let op de piekwaarden in de piektabel en identificeer de piek met de grootste piekhoogte. Schakel het pictogram Setpoints weergeven/verbergen in het bovenste menu in. Aan de rechterkant verschijnt een nieuw paneel.Selecteer Geavanceerd, scrol omlaag naar Uitstrijkje uitvoeren en schakel het selectievakje in. Hiermee wordt de tabel Regio toegevoegd aan het tabblad Elektroferogram. Selecteer vervolgens een elektroferogram en ga naar de tabel Regio.Stel in het menu Van basenpaar en Naar basenpaar het begin- en eindbasenpaar in door met de rechtermuisknop op het elektroferogram te klikken en een gebied te selecteren dat u wilt toevoegen. Klik met de rechtermuisknop op een cel in de tabel Regio en selecteer Regio's wijzigen om een klein nieuw venster pop-up te maken om aangepaste regio's in te stellen. Gebruik deze vergelijking om de poly(A)staartlengte op het mRNA van belang te berekenen.Schakel vervolgens op het tabblad Elektroferogram Grootte weergeven in om de tabel Regio automatisch te converteren van basispaar naar runtime. Open het CSV-bestand en selecteer de waarden die zijn verkregen voor runtime om een grafiek te genereren. Met behulp van dit protocol werden poly(A)staartlengtes van Dscam1- en GAPDH-genen uit Drosophila-larvale hersenen geanalyseerd, terwijl PCR-producten van genspecifieke primerparen een enkele band vertoonden.PCR-producten van de genspecifieke universele primerparen vertoonden verschillende uitstrijkpatronen, wat wijst op differentiële poly(A)lengte van mRNA's. De gemiddelde poly(A)staartlengtes werden verkregen met behulp van uitstrijkjes. En het bereik van de staartlengtes werd weergegeven door elektroferogrammen.Evenzo toonde poly(A)staartlengteanalyse op S2-cellen differentiële poly(A)staartlengtes voor de SV43 prime UTR- en GAPDH-genen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

Isolation of Brain from Drosophila Larvae and Harvest of S2 Schneider Cells

Isolatie van hersenen van Drosophila-larven en oogst van S2 Schneider-cellen

Total RNA Extraction from Drosophila Larvae Brain and S2 Schneider Cells

Totale RNA-extractie uit Drosophila-larven , hersenen en S2 Schneider-cellen