poly a tail length measurement of genes from drosophila brain

Quantifizierung der Poly(A)-Länge von Genen aus dem Drosophila-Nervensystem

Most eukaryotic mRNAs are posttranscriptionally polyadenylated at their 3&#8242; terminus in the nucleus by the addition of non-templated adenosines by canonical poly(A) polymerases. An intact poly(A) tail is pivotal throughout the lifecycle of mRNA, as it is essential for mRNA nuclear export1, facilitates interaction with poly(A)-binding proteins to enhance translational efficiency2, and imparts resistance against degradation3. In certain cases, the poly(A) tail can also undergo extension in the cytoplasm, facilitated by noncanonical poly(A) polymerases4. In the cytoplasm, poly (A) tail length dynamically changes and influences the life span of the mRNA molecule. Numerous polymerases and deadenylases are known for modulating tail length5,6,7. For example, the shortening of poly(A) tails correlates with translational repression, whereas the lengthening of poly(A) tails enhances translation8,9.
Accumulating genomic studies have demonstrated the fundamental significance of the poly(A) tail length across various facets of eukaryotic biology. This includes roles in germ-cell development, early embryonic development, neuronal synaptic plasticity for learning and memory, and the inflammatory response10. There have been numerous methods and assays developed for measuring poly(A) tail lengths. For example, the RNase H/oligo(dT) assay takes advantage of RNase H in the presence or absence of oligo(dT) to study poly(A) tail length11,12. Other methods to study poly(A) tail include the PCR amplification of 3&#39; ends such as rapid amplification of cDNA ends poly(A) test (RACE-PAT)12,13 and the ligase-mediated poly(A) test (LM-PAT)14. Further modifications of the PAT assay include ePAT15 and sPAT16. Enzymatic G-tailing17,18 or G/I-tailing&#160;of the 3&#39; end are other variations of the PAT assay. Further modification of these techniques includes the use of fluorescently labeled primers along with capillary gel electrophoresis for high-resolution analysis, referred to as the high-resolution poly(A) test (Hire-PAT)19. These PCR-driven assays allow fast and high-sensitivity poly(A) length quantitation.
With the development of next-generation sequencing, a high-throughput sequencing method, such as PAL-seq20 and TAIL-seq21, allows polyadenylation analyses at a transcriptome-wide scale. However, these methods provide only short sequencing reads of 36-51 nucleotides. Therefore, FLAM-Seq22 was developed for global tail length profiling of full-length mRNA and provides long reads. Nanopore technology23 provides PCR-independent, direct RNA, or direct cDNA sequencing for poly(A) tail length estimations. However, these high-throughput methods are not without limitations. They require large amounts of starting materials, are expensive, and time-consuming. Moreover, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with high-throughput methods, and low-throughput PCR-based methods still provide an advantage when a small number of transcripts need to be analyzed, for pilot experiments, and validation of other methods.
We have recently demonstrated that Dscam1 mRNAs contain short poly(A) tails in Drosophila, which necessitates a non-canonical binding of the cytoplasmic poly(A)-binding protein on Dscam1 3&#39;UTR using the G/I tailing method24. Here we provide a streamlined procedure for tissue preparation and quantifying poly(A) length of mRNAs from the Drosophila nervous system and Drosophila S2 cells.

Autor im Rampenlicht: Erkundung der Grenzen der mRNA-Forschung mit Poly-A-Schwanz-Analysetechniken

Messung der Poly-A-Schwanzlänge aus Drosophila-Larvengehirn und Zelllinien

Polyadenylation is a post-transcription modification. This add poly-A tails to the three-prime end of mRNA molecules. Dysregulation of polyadenylation has been associated with abnormal gene expression and various diseases, including neurological disorders.Our method provides a cost-effective, high-resolution analysis for measuring poly-A lengths. High-throughput methods for poly-A tail analysis, like next generation sequencing, and a high-throughput sequencing provides high-content information. However, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with these methods.PCR-based methods are usually low-throughput. However, they can be easily used to analyze a small number of transcripts. The GI-tailing method is one of them.With this method, we discovered that Dscam mRNAs contain short poly-A tails. Dscam is a neuronal cell adhesion molecule. It is involved in many important neurodevelopmental processes.Because Dscam mRNA contains short poly-A tails unlike most mRNAs, Dscam mRNA translation is under unique gene regulation, which is one of the questions we are trying to answer.

Poly A Schwanzlängenmessung von Genen aus dem Drosophila-Gehirn

Um mit dem G/I-Tailing zu beginnen, bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Mischung auf Eis mit Gesamt-RNA, Tail-Puffer-Mix und Tail-Enzym-Mix vor. Bei 37 Grad Celsius 60 Minuten in einem Thermocycler inkubieren. Fügen Sie dann die Tail-Stop-Lösung hinzu und halten Sie sie zwei Minuten lang auf Eis.Führen Sie eine reverse Transkription und PCR-Amplifikation durch. Nach der hochauflösenden Gelelektrophorese von PCR-Produkten greifen Sie mit der Software auf die Daten zu. Öffnen Sie die XAD-Datei und wählen Sie im Bedienfeld "Strukturansicht" Beispielnamen oder -kontaktplan aus.Vergrößern und verkleinern Sie Elektropherogramme und gelartige Bilder für eine detaillierte Anzeige. Um die Peakgrößen zu erhalten, öffnen Sie das Elektropherogramm einer ausgewählten Probe. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Elektropherogramm und wählen Sie Manuelle Integration, um Peaks manuell auszuwählen, indem Sie die horizontale Linie ziehen.Beobachten Sie die Spitzenwerte in der Peak-Tabelle und identifizieren Sie den Peak mit der größten Peakhöhe. Aktivieren Sie das Symbol Sollwerte ein-/ausblenden im oberen Menü. Auf der rechten Seite wird ein neues Fenster angezeigt.Wählen Sie Erweitert, scrollen Sie nach unten zu Abstrichanalyse durchführen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen. Dadurch wird die Tabelle Region zur Registerkarte Elektropherogramm hinzugefügt. Wählen Sie dann ein Elektropherogramm aus und gehen Sie zur Tabelle Region.Legen Sie im Menü Von Basenpaar und Bis Basispaar das Start- und Endbasispaar fest, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Elektropherogramm klicken und eine hinzuzufügende Region auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Zelle in der Tabelle Region und wählen Sie Regionen ändern, um ein kleines neues Fenster zum Festlegen benutzerdefinierter Regionen zu erstellen. Verwenden Sie diese Gleichung, um die Poly(A)schwanzlänge auf der interessierenden mRNA zu berechnen.Aktivieren Sie als Nächstes auf der Registerkarte Elektropherogramm die Option Größen anzeigen, um die Tabelle Region automatisch vom Basispaar in die Laufzeit zu konvertieren. Öffnen Sie die CSV-Datei und wählen Sie die für die Laufzeit erhaltenen Werte aus, um ein Diagramm zu generieren. Mit diesem Protokoll wurden Poly(A)schwanzlängen von Dscam1- und GAPDH-Genen aus Drosophila-Larvengehirnen analysiert, während PCR-Produkte von genspezifischen Primerpaaren eine einzelne Bande zeigten.PCR-Produkte aus den genspezifischen universellen Primerpaaren zeigten unterschiedliche Abstrichmuster, was auf eine unterschiedliche Poly(A)länge von mRNAs hinweist. Die durchschnittlichen Poly(A)schwanzlängen wurden mittels Abstrichanalyse ermittelt. Und der Bereich der Schwanzlängen wurde durch Elektropherogramme dargestellt.In ähnlicher Weise zeigte die Poly(A)schwanzlängenanalyse an S2-Zellen unterschiedliche Poly(A)schwanzlängen für die SV43-Prime-UTR- und GAPDH-Gene.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation of Brain from Drosophila Larvae and Harvest of S2 Schneider Cells

Isolierung des Gehirns von Drosophila-Larven und Ernte von S2-Schneiderzellen

Total RNA Extraction from Drosophila Larvae Brain and S2 Schneider Cells

Gesamt-RNA-Extraktion aus Drosophila-Larven , Gehirn und S2-Schneider-Zellen