poly a tail length measurement of genes from drosophila brain

כימות אורך הפולי(A) של גנים ממערכת העצבים דרוזופילה

Most eukaryotic mRNAs are posttranscriptionally polyadenylated at their 3&#8242; terminus in the nucleus by the addition of non-templated adenosines by canonical poly(A) polymerases. An intact poly(A) tail is pivotal throughout the lifecycle of mRNA, as it is essential for mRNA nuclear export1, facilitates interaction with poly(A)-binding proteins to enhance translational efficiency2, and imparts resistance against degradation3. In certain cases, the poly(A) tail can also undergo extension in the cytoplasm, facilitated by noncanonical poly(A) polymerases4. In the cytoplasm, poly (A) tail length dynamically changes and influences the life span of the mRNA molecule. Numerous polymerases and deadenylases are known for modulating tail length5,6,7. For example, the shortening of poly(A) tails correlates with translational repression, whereas the lengthening of poly(A) tails enhances translation8,9.
Accumulating genomic studies have demonstrated the fundamental significance of the poly(A) tail length across various facets of eukaryotic biology. This includes roles in germ-cell development, early embryonic development, neuronal synaptic plasticity for learning and memory, and the inflammatory response10. There have been numerous methods and assays developed for measuring poly(A) tail lengths. For example, the RNase H/oligo(dT) assay takes advantage of RNase H in the presence or absence of oligo(dT) to study poly(A) tail length11,12. Other methods to study poly(A) tail include the PCR amplification of 3&#39; ends such as rapid amplification of cDNA ends poly(A) test (RACE-PAT)12,13 and the ligase-mediated poly(A) test (LM-PAT)14. Further modifications of the PAT assay include ePAT15 and sPAT16. Enzymatic G-tailing17,18 or G/I-tailing&#160;of the 3&#39; end are other variations of the PAT assay. Further modification of these techniques includes the use of fluorescently labeled primers along with capillary gel electrophoresis for high-resolution analysis, referred to as the high-resolution poly(A) test (Hire-PAT)19. These PCR-driven assays allow fast and high-sensitivity poly(A) length quantitation.
With the development of next-generation sequencing, a high-throughput sequencing method, such as PAL-seq20 and TAIL-seq21, allows polyadenylation analyses at a transcriptome-wide scale. However, these methods provide only short sequencing reads of 36-51 nucleotides. Therefore, FLAM-Seq22 was developed for global tail length profiling of full-length mRNA and provides long reads. Nanopore technology23 provides PCR-independent, direct RNA, or direct cDNA sequencing for poly(A) tail length estimations. However, these high-throughput methods are not without limitations. They require large amounts of starting materials, are expensive, and time-consuming. Moreover, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with high-throughput methods, and low-throughput PCR-based methods still provide an advantage when a small number of transcripts need to be analyzed, for pilot experiments, and validation of other methods.
We have recently demonstrated that Dscam1 mRNAs contain short poly(A) tails in Drosophila, which necessitates a non-canonical binding of the cytoplasmic poly(A)-binding protein on Dscam1 3&#39;UTR using the G/I tailing method24. Here we provide a streamlined procedure for tissue preparation and quantifying poly(A) length of mRNAs from the Drosophila nervous system and Drosophila S2 cells.

מחבר זרקור: לחקור את הגבול של מחקר mRNA עם טכניקות ניתוח זנב Poly A

מדידת אורך זנב Poly A מזחלי דרוזופילה מוח וקו תאים

Polyadenylation is a post-transcription modification. This add poly-A tails to the three-prime end of mRNA molecules. Dysregulation of polyadenylation has been associated with abnormal gene expression and various diseases, including neurological disorders.Our method provides a cost-effective, high-resolution analysis for measuring poly-A lengths. High-throughput methods for poly-A tail analysis, like next generation sequencing, and a high-throughput sequencing provides high-content information. However, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with these methods.PCR-based methods are usually low-throughput. However, they can be easily used to analyze a small number of transcripts. The GI-tailing method is one of them.With this method, we discovered that Dscam mRNAs contain short poly-A tails. Dscam is a neuronal cell adhesion molecule. It is involved in many important neurodevelopmental processes.Because Dscam mRNA contains short poly-A tails unlike most mRNAs, Dscam mRNA translation is under unique gene regulation, which is one of the questions we are trying to answer.

פולי A מדידת אורך זנב של גנים ממוח דרוזופילה

כדי להתחיל בזנב G/I, הכינו תערובת של 20 מיקרוליטר על קרח עם RNA כולל, תערובת חיץ זנב ותערובת אנזימי זנב. לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות thermocycler. לאחר מכן, הוסף תמיסת עצירת זנב ושמור על קרח במשך שתי דקות.בצע תמלול הפוך והגברת PCR. לאחר אלקטרופורזה ג'ל ברזולוציה גבוהה של מוצרי PCR, לגשת לנתונים באמצעות התוכנה. פתח את קובץ XAD ובחר שמות לדוגמה או סולם בחלונית Tree View.הגדל והקטן את התצוגה של אלקטרופרוגרמות ותמונות דמויות ג'ל לקבלת תצוגה מפורטת. כדי להשיג את גדלי השיא, פתח את האלקטרופרוגרמה של מדגם שנבחר. לחץ לחיצה ימנית על אלקטרופרוגרמה ובחר שילוב ידני כדי לבחור פסגות באופן ידני על ידי גרירת הקו האופקי.התבונן בערכי השיא בטבלת השיא וזהה את הפסגה עם גובה השיא הגדול ביותר. הפעל את סמל הצג/הסתר נקודות קבע בתפריט העליון. פאנל חדש יופיע בצד ימין.בחר מתקדם, גלול מטה אל בצע ניתוח מריחות ובחר בתיבת הסימון. פעולה זו תוסיף את הטבלה אזור לכרטיסיה אלקטרופרוגרמה. לאחר מכן בחר אלקטרופרוגרמה ועבור לטבלה אזור.בתפריט From Base Pair ו- To Base Pair, הגדר את זוג הבסיס המתחיל והמסתיים על-ידי לחיצה ימנית על האלקטרופרוגרמה ובחירת אזור להוספה. לחץ לחיצה ימנית על תא כלשהו בטבלת האזורים ובחר שנה אזורים כדי ליצור חלון חדש קטן מוקפץ להגדרת אזורים מותאמים אישית. השתמש במשוואה זו כדי לחשב את אורך הזנב של פולי(A) על mRNA של עניין.לאחר מכן, בכרטיסיה אלקטרופרוגרמה, סמן את הצג גדלים כדי להמיר באופן אוטומטי את טבלת האזור מזוג בסיסים לזמן ריצה. פתח את קובץ ה- CSV ובחר את הערכים המתקבלים עבור זמן ריצה ליצירת תרשים. באמצעות פרוטוקול זה, אורכי זנב פולי(A) של גנים Dscam1 ו-GAPDH ממוחות זחלי דרוזופילה נותחו, בעוד שתוצרי PCR מזוגות פריימרים ספציפיים לגנים הראו פס יחיד.תוצרי PCR מזוגות פריימר אוניברסליים ספציפיים לגן הראו דפוסי מריחה ברורים, המצביעים על אורך פולי(A) דיפרנציאלי של mRNA. אורכי הזנב הממוצעים של פולי(A) התקבלו באמצעות ניתוח מריחה. ואת טווח אורכי הזנב היו מיוצגים על ידי electropherograms.באופן דומה, ניתוח אורך זנב פולי(A) בתאי S2 הראה אורכי זנב דיפרנציאליים של פולי(A) עבור הגנים SV43 prime UTR ו-GAPDH.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

Isolation of Brain from Drosophila Larvae and Harvest of S2 Schneider Cells

בידוד המוח מזחלי דרוזופילה וקציר תאי שניידר S2

Total RNA Extraction from Drosophila Larvae Brain and S2 Schneider Cells

מיצוי RNA כולל מזחלי דרוזופילה במוח ותאי שניידר S2