poly a tail length measurement of genes from drosophila brain

Quantificazione della lunghezza Poly(A) dei geni del sistema nervoso della Drosophila

Most eukaryotic mRNAs are posttranscriptionally polyadenylated at their 3&#8242; terminus in the nucleus by the addition of non-templated adenosines by canonical poly(A) polymerases. An intact poly(A) tail is pivotal throughout the lifecycle of mRNA, as it is essential for mRNA nuclear export1, facilitates interaction with poly(A)-binding proteins to enhance translational efficiency2, and imparts resistance against degradation3. In certain cases, the poly(A) tail can also undergo extension in the cytoplasm, facilitated by noncanonical poly(A) polymerases4. In the cytoplasm, poly (A) tail length dynamically changes and influences the life span of the mRNA molecule. Numerous polymerases and deadenylases are known for modulating tail length5,6,7. For example, the shortening of poly(A) tails correlates with translational repression, whereas the lengthening of poly(A) tails enhances translation8,9.
Accumulating genomic studies have demonstrated the fundamental significance of the poly(A) tail length across various facets of eukaryotic biology. This includes roles in germ-cell development, early embryonic development, neuronal synaptic plasticity for learning and memory, and the inflammatory response10. There have been numerous methods and assays developed for measuring poly(A) tail lengths. For example, the RNase H/oligo(dT) assay takes advantage of RNase H in the presence or absence of oligo(dT) to study poly(A) tail length11,12. Other methods to study poly(A) tail include the PCR amplification of 3&#39; ends such as rapid amplification of cDNA ends poly(A) test (RACE-PAT)12,13 and the ligase-mediated poly(A) test (LM-PAT)14. Further modifications of the PAT assay include ePAT15 and sPAT16. Enzymatic G-tailing17,18 or G/I-tailing&#160;of the 3&#39; end are other variations of the PAT assay. Further modification of these techniques includes the use of fluorescently labeled primers along with capillary gel electrophoresis for high-resolution analysis, referred to as the high-resolution poly(A) test (Hire-PAT)19. These PCR-driven assays allow fast and high-sensitivity poly(A) length quantitation.
With the development of next-generation sequencing, a high-throughput sequencing method, such as PAL-seq20 and TAIL-seq21, allows polyadenylation analyses at a transcriptome-wide scale. However, these methods provide only short sequencing reads of 36-51 nucleotides. Therefore, FLAM-Seq22 was developed for global tail length profiling of full-length mRNA and provides long reads. Nanopore technology23 provides PCR-independent, direct RNA, or direct cDNA sequencing for poly(A) tail length estimations. However, these high-throughput methods are not without limitations. They require large amounts of starting materials, are expensive, and time-consuming. Moreover, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with high-throughput methods, and low-throughput PCR-based methods still provide an advantage when a small number of transcripts need to be analyzed, for pilot experiments, and validation of other methods.
We have recently demonstrated that Dscam1 mRNAs contain short poly(A) tails in Drosophila, which necessitates a non-canonical binding of the cytoplasmic poly(A)-binding protein on Dscam1 3&#39;UTR using the G/I tailing method24. Here we provide a streamlined procedure for tissue preparation and quantifying poly(A) length of mRNAs from the Drosophila nervous system and Drosophila S2 cells.

Autore in primo piano: Esplorare la frontiera della ricerca sull'mRNA con le tecniche di analisi della coda di polietilene A

Misurazione della lunghezza della coda di Poly A dal cervello e dalla linea cellulare della larva di Drosophila

Polyadenylation is a post-transcription modification. This add poly-A tails to the three-prime end of mRNA molecules. Dysregulation of polyadenylation has been associated with abnormal gene expression and various diseases, including neurological disorders.Our method provides a cost-effective, high-resolution analysis for measuring poly-A lengths. High-throughput methods for poly-A tail analysis, like next generation sequencing, and a high-throughput sequencing provides high-content information. However, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with these methods.PCR-based methods are usually low-throughput. However, they can be easily used to analyze a small number of transcripts. The GI-tailing method is one of them.With this method, we discovered that Dscam mRNAs contain short poly-A tails. Dscam is a neuronal cell adhesion molecule. It is involved in many important neurodevelopmental processes.Because Dscam mRNA contains short poly-A tails unlike most mRNAs, Dscam mRNA translation is under unique gene regulation, which is one of the questions we are trying to answer.

Misurazione della lunghezza della coda Poly A dei geni del cervello di Drosophila

Per iniziare la coda G/I, preparare una miscela da 20 microlitri su ghiaccio con RNA totale, miscela tampone di coda e miscela di enzimi di coda. Incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti in un termociclatore. Quindi, aggiungere la soluzione di arresto della coda e tenere sul ghiaccio per due minuti.Eseguire la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR. Dopo l'elettroforesi su gel ad alta risoluzione dei prodotti PCR, accedere ai dati utilizzando il software. Aprite il file XAD e selezionate i nomi dei campioni o la scala nel pannello Vista struttura.Ingrandisci e rimpicciolisci gli elettroferogrammi e le immagini gelatinose per una visualizzazione dettagliata. Per ottenere le dimensioni dei picchi, aprire l'elettroferogramma di un campione selezionato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'elettroferogramma e selezionare l'integrazione manuale per selezionare manualmente i picchi trascinando la linea orizzontale.Osservare i valori dei picchi nella tabella dei picchi e identificare il picco con l'altezza del picco maggiore. Abilita l'icona Mostra/Nascondi Setpoint nel menu in alto. Apparirà un nuovo pannello sul lato destro.Selezionare Avanzate, scorrere verso il basso fino a Esegui analisi striscio e selezionare la casella di controllo. In questo modo la tabella Regione verrà aggiunta alla scheda Elettroferogramma. Quindi seleziona un elettroferogramma e vai alla tabella Regione.Nel menu Da coppia di basi e Alla coppia di basi, impostare la coppia di basi iniziale e finale facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'elettroferogramma e selezionando una regione da aggiungere. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi cella nella tabella Regione e selezionare Modifica regioni per creare una nuova finestra popup per impostare le regioni personalizzate. Usa questa equazione per calcolare la lunghezza della poli(A)coda sull'mRNA di interesse.Successivamente, nella scheda Elettroferogramma, selezionare Mostra dimensioni per convertire automaticamente la tabella Regione da coppia di basi a runtime. Aprire il file CSV e selezionare i valori ottenuti per il runtime per generare un grafico. Utilizzando questo protocollo, sono state analizzate le lunghezze della poli(A)coda dei geni Dscam1 e GAPDH dal cervello larvale di Drosophila, mentre i prodotti PCR da coppie di primer geneticamente specifici hanno mostrato una singola banda.I prodotti della PCR delle coppie di primer universali geneticamente specifici hanno mostrato modelli di striscio distinti, indicando una lunghezza differenziale di poli(A) degli mRNA. Le lunghezze medie della poly(A)tail sono state ottenute utilizzando l'analisi dello striscio. E la gamma delle lunghezze della coda era rappresentata dagli elettroferogrammi.Allo stesso modo, l'analisi della lunghezza della poli(A)coda sulle cellule S2 ha mostrato lunghezze differenziali della poli(A)coda per i geni SV43 prime UTR e GAPDH.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

Ricerca

Neuroscienze

Isolation of Brain from Drosophila Larvae and Harvest of S2 Schneider Cells

Isolamento del cervello dalle larve di Drosophila e raccolta di cellule Schneider S2

Total RNA Extraction from Drosophila Larvae Brain and S2 Schneider Cells

Estrazione totale di RNA da Larve di Drosophila , cervello e cellule S2 di Schneider