poly a tail length measurement of genes from drosophila brain

ショウジョウバエ神経系からの遺伝子のポリ(A)長の定量化

Most eukaryotic mRNAs are posttranscriptionally polyadenylated at their 3&#8242; terminus in the nucleus by the addition of non-templated adenosines by canonical poly(A) polymerases. An intact poly(A) tail is pivotal throughout the lifecycle of mRNA, as it is essential for mRNA nuclear export1, facilitates interaction with poly(A)-binding proteins to enhance translational efficiency2, and imparts resistance against degradation3. In certain cases, the poly(A) tail can also undergo extension in the cytoplasm, facilitated by noncanonical poly(A) polymerases4. In the cytoplasm, poly (A) tail length dynamically changes and influences the life span of the mRNA molecule. Numerous polymerases and deadenylases are known for modulating tail length5,6,7. For example, the shortening of poly(A) tails correlates with translational repression, whereas the lengthening of poly(A) tails enhances translation8,9.
Accumulating genomic studies have demonstrated the fundamental significance of the poly(A) tail length across various facets of eukaryotic biology. This includes roles in germ-cell development, early embryonic development, neuronal synaptic plasticity for learning and memory, and the inflammatory response10. There have been numerous methods and assays developed for measuring poly(A) tail lengths. For example, the RNase H/oligo(dT) assay takes advantage of RNase H in the presence or absence of oligo(dT) to study poly(A) tail length11,12. Other methods to study poly(A) tail include the PCR amplification of 3&#39; ends such as rapid amplification of cDNA ends poly(A) test (RACE-PAT)12,13 and the ligase-mediated poly(A) test (LM-PAT)14. Further modifications of the PAT assay include ePAT15 and sPAT16. Enzymatic G-tailing17,18 or G/I-tailing&#160;of the 3&#39; end are other variations of the PAT assay. Further modification of these techniques includes the use of fluorescently labeled primers along with capillary gel electrophoresis for high-resolution analysis, referred to as the high-resolution poly(A) test (Hire-PAT)19. These PCR-driven assays allow fast and high-sensitivity poly(A) length quantitation.
With the development of next-generation sequencing, a high-throughput sequencing method, such as PAL-seq20 and TAIL-seq21, allows polyadenylation analyses at a transcriptome-wide scale. However, these methods provide only short sequencing reads of 36-51 nucleotides. Therefore, FLAM-Seq22 was developed for global tail length profiling of full-length mRNA and provides long reads. Nanopore technology23 provides PCR-independent, direct RNA, or direct cDNA sequencing for poly(A) tail length estimations. However, these high-throughput methods are not without limitations. They require large amounts of starting materials, are expensive, and time-consuming. Moreover, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with high-throughput methods, and low-throughput PCR-based methods still provide an advantage when a small number of transcripts need to be analyzed, for pilot experiments, and validation of other methods.
We have recently demonstrated that Dscam1 mRNAs contain short poly(A) tails in Drosophila, which necessitates a non-canonical binding of the cytoplasmic poly(A)-binding protein on Dscam1 3&#39;UTR using the G/I tailing method24. Here we provide a streamlined procedure for tissue preparation and quantifying poly(A) length of mRNAs from the Drosophila nervous system and Drosophila S2 cells.

著者スポットライト:Poly A Tail解析技術によるmRNA研究のフロンティアの探求

ショウジョウバエ幼虫の脳および細胞株からのPoly A尾長の測定

Polyadenylation is a post-transcription modification. This add poly-A tails to the three-prime end of mRNA molecules. Dysregulation of polyadenylation has been associated with abnormal gene expression and various diseases, including neurological disorders.Our method provides a cost-effective, high-resolution analysis for measuring poly-A lengths. High-throughput methods for poly-A tail analysis, like next generation sequencing, and a high-throughput sequencing provides high-content information. However, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with these methods.PCR-based methods are usually low-throughput. However, they can be easily used to analyze a small number of transcripts. The GI-tailing method is one of them.With this method, we discovered that Dscam mRNAs contain short poly-A tails. Dscam is a neuronal cell adhesion molecule. It is involved in many important neurodevelopmental processes.Because Dscam mRNA contains short poly-A tails unlike most mRNAs, Dscam mRNA translation is under unique gene regulation, which is one of the questions we are trying to answer.

ショウジョウバエ脳由来遺伝子のPoly A尾長測定

G/Iテーリングを開始するには、トータルRNA、テールバッファーミックス、テール酵素ミックスを含む20マイクロリットルの混合物を氷上で調製します。サーモサイクラーで摂氏37度で60分間インキュベートします。次に、テールストップ溶液を加え、2分間氷上に置きます。逆転写とPCR増幅を行います。PCR産物の高分解能ゲル電気泳動後、ソフトウェアを使用してデータにアクセスします。XAD ファイルを開き、[ツリー ビュー] パネルでサンプル名またはラダーを選択します。エレクトロフェログラムやゲル状の画像をズームインおよびズームアウトして、詳細に表示します。ピークサイズを取得するには、選択したサンプルのエレクトロフェログラムを開きます。エレクトロフェログラムを右クリックして手動積分を選択し、水平線をドラッグしてピークを手動で選択します。ピークテーブルでピーク値を観察し、ピーク高さが最大のピークを特定します。トップメニューのShow/Hide Setpoints(セットポイントの表示/非表示)アイコンを有効にします。右側に新しいパネルがポップアップ表示されます。[詳細設定]を選択し、[にじみ分析の実行]まで下にスクロールして、チェックボックスを選択します。これにより、[Region] テーブルが [Electropherogram] タブに追加されます。次に、エレクトロフェログラムを選択し、領域テーブルに移動します。From Base PairおよびTo Base Pairメニューで、エレクトロフェログラムを右クリックし、追加する領域を選択することにより、開始塩基対と終了塩基対を設定します。[Region] テーブルの任意のセルを右クリックし、[Modify Regions] を選択して、カスタム領域を設定するための小さな新しいウィンドウ ポップアップを作成します。この式を使用して、目的のmRNAのポリ(A)テール長を計算します。次に、[エレクトロフェログラム]タブで[サイズを表示]をオンにして、領域テーブルを塩基対からランタイムに自動的に変換します。CSVファイルを開き、実行時に取得した値を選択してグラフを生成します。このプロトコルを使用して、ショウジョウバエの幼虫の頭脳からのDscam1およびGAPDH遺伝子の多(A)尾長は遺伝子特定のプライマー組からのPCRの産物が単一のバンドを示した間、分析された。遺伝子特異的ユニバーサルプライマーペア由来のPCR産物は、mRNAのポリ(A)長が異なることを示す明瞭な塗抹標本パターンを示しました。ポリ(A)テールの平均長さは、塗抹標本分析を使用して取得しました。そして、尾の長さの範囲は電気ペログラムで表されました。同様に、S2細胞のポリ(A)テール長解析では、SV43プライムUTR遺伝子とGAPDH遺伝子のポリ(A)テール長に差があることが示されました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

神経科学

Isolation of Brain from Drosophila Larvae and Harvest of S2 Schneider Cells

ショウジョウバエ幼虫からの脳の分離とS2シュナイダー細胞の採取

Total RNA Extraction from Drosophila Larvae Brain and S2 Schneider Cells

ショウジョウバエ幼虫脳およびS2シュナイダー細胞からのトータルRNA抽出