poly a tail length measurement of genes from drosophila brain

Drosophila Nervous System에서 유전자의 Poly(A) 길이를 정량화합니다.

Most eukaryotic mRNAs are posttranscriptionally polyadenylated at their 3&#8242; terminus in the nucleus by the addition of non-templated adenosines by canonical poly(A) polymerases. An intact poly(A) tail is pivotal throughout the lifecycle of mRNA, as it is essential for mRNA nuclear export1, facilitates interaction with poly(A)-binding proteins to enhance translational efficiency2, and imparts resistance against degradation3. In certain cases, the poly(A) tail can also undergo extension in the cytoplasm, facilitated by noncanonical poly(A) polymerases4. In the cytoplasm, poly (A) tail length dynamically changes and influences the life span of the mRNA molecule. Numerous polymerases and deadenylases are known for modulating tail length5,6,7. For example, the shortening of poly(A) tails correlates with translational repression, whereas the lengthening of poly(A) tails enhances translation8,9.
Accumulating genomic studies have demonstrated the fundamental significance of the poly(A) tail length across various facets of eukaryotic biology. This includes roles in germ-cell development, early embryonic development, neuronal synaptic plasticity for learning and memory, and the inflammatory response10. There have been numerous methods and assays developed for measuring poly(A) tail lengths. For example, the RNase H/oligo(dT) assay takes advantage of RNase H in the presence or absence of oligo(dT) to study poly(A) tail length11,12. Other methods to study poly(A) tail include the PCR amplification of 3&#39; ends such as rapid amplification of cDNA ends poly(A) test (RACE-PAT)12,13 and the ligase-mediated poly(A) test (LM-PAT)14. Further modifications of the PAT assay include ePAT15 and sPAT16. Enzymatic G-tailing17,18 or G/I-tailing&#160;of the 3&#39; end are other variations of the PAT assay. Further modification of these techniques includes the use of fluorescently labeled primers along with capillary gel electrophoresis for high-resolution analysis, referred to as the high-resolution poly(A) test (Hire-PAT)19. These PCR-driven assays allow fast and high-sensitivity poly(A) length quantitation.
With the development of next-generation sequencing, a high-throughput sequencing method, such as PAL-seq20 and TAIL-seq21, allows polyadenylation analyses at a transcriptome-wide scale. However, these methods provide only short sequencing reads of 36-51 nucleotides. Therefore, FLAM-Seq22 was developed for global tail length profiling of full-length mRNA and provides long reads. Nanopore technology23 provides PCR-independent, direct RNA, or direct cDNA sequencing for poly(A) tail length estimations. However, these high-throughput methods are not without limitations. They require large amounts of starting materials, are expensive, and time-consuming. Moreover, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with high-throughput methods, and low-throughput PCR-based methods still provide an advantage when a small number of transcripts need to be analyzed, for pilot experiments, and validation of other methods.
We have recently demonstrated that Dscam1 mRNAs contain short poly(A) tails in Drosophila, which necessitates a non-canonical binding of the cytoplasmic poly(A)-binding protein on Dscam1 3&#39;UTR using the G/I tailing method24. Here we provide a streamlined procedure for tissue preparation and quantifying poly(A) length of mRNAs from the Drosophila nervous system and Drosophila S2 cells.

저자 스포트라이트: Poly A Tail Analysis Techniques를 통한 mRNA 연구의 지평 개척

Drosophila Larva Brain and Cell Line의 Poly A 꼬리 길이 측정

Polyadenylation is a post-transcription modification. This add poly-A tails to the three-prime end of mRNA molecules. Dysregulation of polyadenylation has been associated with abnormal gene expression and various diseases, including neurological disorders.Our method provides a cost-effective, high-resolution analysis for measuring poly-A lengths. High-throughput methods for poly-A tail analysis, like next generation sequencing, and a high-throughput sequencing provides high-content information. However, analyzing rare transcripts can be extremely challenging with these methods.PCR-based methods are usually low-throughput. However, they can be easily used to analyze a small number of transcripts. The GI-tailing method is one of them.With this method, we discovered that Dscam mRNAs contain short poly-A tails. Dscam is a neuronal cell adhesion molecule. It is involved in many important neurodevelopmental processes.Because Dscam mRNA contains short poly-A tails unlike most mRNAs, Dscam mRNA translation is under unique gene regulation, which is one of the questions we are trying to answer.

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain (초파리 뇌의 유전자 꼬리 길이 측정)

G/I 테일링을 시작하려면 총 RNA, 테일 버퍼 믹스 및 테일 효소 믹스와 함께 얼음 위에 20마이크로리터 혼합물을 준비합니다. 섭씨 37도에서 열순환기에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 테일 스톱 용액을 넣고 2분 동안 얼음 위에 두십시오.역전사 및 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 산물의 고분해능 겔 전기영동 후 소프트웨어를 사용하여 데이터에 액세스합니다. XAD 파일을 열고 트리 뷰 패널에서 샘플 이름 또는 래더를 선택합니다.일렉트로페로그램과 젤 같은 이미지를 확대 및 축소하여 자세히 표시합니다. 피크 크기를 얻으려면 선택한 샘플의 전기 페로그램을 엽니다. electropherogram을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 수동 적분을 선택하면 수평선을 드래그하여 피크를 수동으로 선택할 수 있습니다.피크 테이블에서 피크 값을 관찰하고 피크 높이가 가장 큰 피크를 식별합니다. 상단 메뉴에서 설정값 표시/숨기기 아이콘을 활성화합니다. 오른쪽에 새 패널이 나타납니다.Advanced(고급)를 선택하고 Perform Smear Analysis(스미어 분석 수행)까지 아래로 스크롤한 다음 확인란을 선택합니다. 이렇게 하면 지역 테이블이 Electropherogram 탭에 추가됩니다. 그런 다음 일렉트로페로그램을 선택하고 지역 테이블로 이동합니다.베이스 쌍에서 베이스 쌍으로(From Base Pair) 및 베이스 쌍으로(To Base Pair) 메뉴에서 일렉트로페로그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추가할 영역을 선택하여 시작 및 끝 베이스 쌍을 설정합니다. 지역 테이블의 아무 셀이나 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 지역 수정을 선택하여 사용자 지정 영역을 설정할 수 있는 작은 새 창 팝업을 만듭니다. 이 방정식을 사용하여 관심 있는 mRNA의 poly(A)tail length를 계산합니다.그런 다음 Electropherogram 탭에서 Show Sizes 를 선택하여 Region 테이블을 베이스 페어에서 런타임으로 자동 변환합니다. CSV 파일을 열고 런타임에 대해 얻은 값을 선택하여 그래프를 생성합니다. 이 프로토콜을 사용하여 초파리 유충 뇌의 Dscam1 및 GAPDH 유전자의 poly(A)tail length를 분석한 반면 유전자 특이적 프라이머 쌍의 PCR 산물은 단일 밴드를 보여주었습니다.유전자 특이적 범용 프라이머 쌍의 PCR 산물은 mRNA의 차등 poly(A) 길이를 나타내는 뚜렷한 도말 패턴을 보여주었습니다. 평균 폴리(A)꼬리 길이는 스미어 분석을 사용하여 구했습니다. 그리고 꼬리 길이의 범위는 전기 페로그램으로 표현되었습니다.유사하게, S2 세포에 대한 poly(A)tail length 분석은 SV43 prime UTR 및 GAPDH 유전자에 대한 다중(A)꼬리 길이의 차이를 보여주었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Poly A Tail Length Measurement of Genes from Drosophila Brain

Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line

Polyadenylation is a crucial posttranscriptional modification that adds poly(A) tails to the 3' end of mRNA molecules. The length of the poly(A) tail is ...

연구

신경과학

Isolation of Brain from Drosophila Larvae and Harvest of S2 Schneider Cells

초파리 유충에서 뇌 분리 및 S2 슈나이더 세포 채취

Total RNA Extraction from Drosophila Larvae Brain and S2 Schneider Cells

Drosophila 유충 뇌 및 S2 슈나이더 세포에서 총 RNA 추출