nanosensor characterization and crispr-cas mediated urine biomarker test for cancer diagnostics

اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي CRISPR-Cas لتشخيص السرطان

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

تسليط الضوء على المؤلف: الأدوات الجزيئية الهندسية للكشف عن الأمراض والتصوير

اختبار العلامات الحيوية للبول الاصطناعي متعدد التحليلات بوساطة كريسبر-كاس للتشخيص المحمول

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

توصيف أجهزة الاستشعار النانوية واختبار العلامات الحيوية للبول بوساطة كريسبر-كاس لتشخيص السرطان

للبدء ، قم بإذابة ملليغرام من PEG متعدد التكافؤ مع مجموعة ماليميد التفاعلية ، ومليلتر واحد من 100 مليمول فوسفات عازل. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. أضف اتحادات ببتيد الحمض النووي المنتهي بالسيستين إلى المحلول.استخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لإزالة المواد غير المقترنة. قم بتشغيل العينات في PBS. مراقبة امتصاص للكشف عن الحمض النووي والببتيدات.ضع العينة في أنابيب مرشح الطرد المركزي وقم بتركيز المستشعرات النانوية المركبة عن طريق الطرد المركزي وفقا للسرعة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. استخدم صفيحة 96 بئرا كقاعدة لغرفة الإسكان المخصصة. لجمع البول لقياسات خط الأساس ، ضع الماوس أولا في غرفة السكن.اضغط برفق على مثانة الفأر المقيدة لطرد أي بول متبقي على الطبق. ماصة البول الذي تم جمعه في أنبوب 1.5 ملليلتر. تحضير 200 ميكرولتر من محلول حقن المستشعر النانوي في برنامج تلفزيوني معقم.حقن 200 ميكرولتر من المحلول عن طريق الوريد في كل ماوس. بعد ساعة واحدة من الحقن ، اجمع عينات البول من الفئران الضابطة والتجريبية. للكشف عن كريسبر القائم على التألق للرموز الشريطية للحمض النووي ، قم بطرد عينات البول عند 800 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.الآن اجمع كواشف كريسبر ، ثم أضف إنزيم Cas12a قبل سحب خليط التفاعل برفق لأعلى ولأسفل. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتشغيل رد فعل المراسل باستخدام خليط الحمض النووي للمراسل القائم على FRET.أضف الخليط إلى طبق من 384 بئرا وقم بقياس التألق على الفور عند 37 درجة مئوية كل دقيقتين لمدة ثلاث ساعات لمراقبة حركية الانقسام. لإجراء الكشف الورقي عن كريسبر ، قم بتشغيل رد فعل مراسل بديل بعد حضانة تفاعل كريسبر باستخدام مراسل الحمض النووي المسمى FAM-Biotin. بعد دمج الكواشف في صفيحة 96 بئرا ، قم بتغطيتها بورق الألمنيوم ، ثم ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.أضف الآن 80 ميكرولترا من PBS إلى بئر جديد من صفيحة 96 بئرا. ماصة 20 ميكرولتر من خليط تفاعل المراسل في هذا البئر. ضع شريط ورق التدفق الجانبي على كل بئر ، وانتظر حتى يصل السائل إلى أعلى الشريط.أظهر الحمض النووي أحادي الشريط المعدل كيميائيا تنشيط Cas12a بالنسبة إلى الحمض النووي المزدوج غير المعدل الذي تقطعت به السبل والحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. أظهرت جزيئات الحمض النووي المعدلة في البول غير المعالج قراءات لونية على شرائط ورق التدفق الجانبي. أشار نطاق العينة الرئيسي إلى إطلاق FAM القابل للكشف من خلال انشقاق المراسل الناجم عن الحمض النووي البولي.