nanosensor characterization and crispr-cas mediated urine biomarker test for cancer diagnostics

CRISPR-Cas synthetische urine-biomarkertest voor kankerdiagnostiek

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

Auteur in de schijnwerpers: technische moleculaire hulpmiddelen voor ziektedetectie en beeldvorming

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

Nanosensorkarakterisering en CRISPR-Cas-gemedieerde urinebiomarkertest voor kankerdiagnostiek

Los om te beginnen twee milligram multivalente PEG op met de maleimide-reactieve groep en één milliliter 100 millimolair fosfaatbuffer. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 micrometer. Voeg de cysteïne-geëindigde DNA-peptideconjugaten toe aan de oplossing.Gebruik chromatografie met uitsluiting van grootte om de niet-geconjugeerde materialen te verwijderen. Voer de voorbeelden uit in PBS. Bewaak de absorptie van de om DNA en peptiden te detecteren.Plaats het monster in de centrifugaalfilterbuizen en concentreer de gesynthetiseerde nanosensoren door centrifugatie volgens de door de fabrikant aanbevolen snelheid. Gebruik een plaat met 96 putjes als basis voor een op maat gemaakte behuizingskamer. Om de urine op te vangen voor nulmetingen, plaatst u eerst een muis in de huisvestingskamer.Oefen lichte druk uit op de blaas van de vastgehouden muis om eventuele resterende urine op de plaat te verdrijven. Pipeteer de opgevangen urine in een buis van 1,5 milliliter. Bereid 200 microliter van de nanosensor-injectieoplossing in steriele PBS.Injecteer intraveneus 200 microliter van de oplossing in elke muis. Verzamel na een uur injectie de urinemonsters van de controle- en experimentele muizen. Voor op fluorescentie gebaseerde CRISPR-detectie van de DNA-barcodes, centrifugeert u de urinemonsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 800 G.Combineer nu de CRISPR-reagentia en voeg vervolgens het Cas12a-enzym toe voordat u het reactiemengsel voorzichtig op en neer pipettert. Incubeer het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voer vervolgens de reporterreactie uit met behulp van het op FRET gebaseerde reporter-DNA-mengsel.Voeg het mengsel toe aan een plaat met 384 putjes en meet onmiddellijk de fluorescentie bij 37 graden Celsius om de twee minuten gedurende drie uur om de kinetiek van de splitsing te controleren. Om op papier gebaseerde CRISPR-detectie uit te voeren, voert u een alternatieve reporterreactie uit na de incubatie van de CRISPR-reactie met behulp van een FAM-Biotine-gelabelde DNA-reporter. Nadat u de reagentia hebt gecombineerd tot een plaat met 96 putjes, dekt u deze af met aluminiumfolie en plaatst u de plaat gedurende 30 minuten in een incubator bij 37 graden Celsius.Voeg nu 80 microliter PBS toe aan een vers putje van een bord met 96 putjes. Pipetteer 20 microliter reporterreactiemengsel in dit putje. Plaats een papieren strook met zijstroom op elk putje en wacht tot de vloeistof de bovenkant van de strook bereikt.Het chemisch gemodificeerde enkelstrengs DNA vertoonde Cas12a-activering ten opzichte van het niet-gemodificeerde dubbelstrengs DNA en enkelstrengs DNA. Gemodificeerde DNA-moleculen in onbewerkte urine vertoonden colorimetrische uitlezing op laterale stroompapierstroken. De leidende monsterband gaf de afgifte van detecteerbare FAM aan door de splitsing van de verslaggever veroorzaakt door urine-DNA.