nanosensor characterization and crispr-cas mediated urine biomarker test for cancer diagnostics

CRISPR-Cas Synthetischer Urin-Biomarker-Test für die Krebsdiagnostik

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung molekularer Werkzeuge für die Erkennung und Bildgebung von Krankheiten

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

Nanosensor-Charakterisierung und CRISPR-Cas-vermittelter Urin-Biomarker-Test für die Krebsdiagnostik

Lösen Sie zunächst zwei Milligramm multivalentes PEG mit Maleimid-reaktiver Gruppe und einen Milliliter 100-Millimol-Phosphatpuffer auf. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter. Fügen Sie der Lösung die Cystein-terminierten DNA-Peptid-Konjugate hinzu.Verwenden Sie die Größenausschlusschromatographie, um die nicht konjugierten Materialien zu entfernen. Führen Sie die Beispiele in PBS aus. Überwachen Sie die Absorption der zum Nachweis von DNA und Peptiden.Geben Sie die Probe in die Zentrifugalfilterröhrchen und konzentrieren Sie die synthetisierten Nanosensoren durch Zentrifugation gemäß der vom Hersteller empfohlenen Geschwindigkeit. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte als Basis für eine kundenspezifische Gehäusekammer. Um den Urin für Basismessungen zu sammeln, legen Sie zuerst eine Maus in die Gehäusekammer.Üben Sie sanften Druck auf die Blase der gefesselten Maus aus, um den verbleibenden Urin auf die Platte auszustoßen. Pipettieren Sie den gesammelten Urin in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Bereiten Sie 200 Mikroliter der Nanosensor-Injektionslösung in sterilem PBS vor.Injizieren Sie intravenös 200 Mikroliter der Lösung in jede Maus. Sammeln Sie nach einer Stunde Injektion die Urinproben von den Kontroll- und Versuchsmäusen. Für die fluoreszenzbasierte CRISPR-Detektion der DNA-Barcodes zentrifugieren Sie die Urinproben bei 800 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Kombinieren Sie nun die CRISPR-Reagenzien, fügen Sie dann das Cas12a-Enzym hinzu, bevor Sie das Reaktionsgemisch vorsichtig auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Führen Sie dann die Reporterreaktion mit der FRET-basierten Reporter-DNA-Mischung durch.Geben Sie die Mischung in eine 384-Well-Platte und messen Sie sofort die Fluoreszenz bei 37 Grad Celsius alle zwei Minuten für drei Stunden, um die Spaltkinetik zu überwachen. Um einen papierbasierten CRISPR-Nachweis durchzuführen, führen Sie nach der Inkubation der CRISPR-Reaktion eine alternative Reporterreaktion mit einem FAM-Biotin-markierten DNA-Reporter durch. Nachdem Sie die Reagenzien zu einer 96-Well-Platte kombiniert haben, decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab und legen Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator.Geben Sie nun 80 Mikroliter PBS in eine frische Vertiefung einer 96-Well-Platte. Pipettieren Sie 20 Mikroliter Reporterreaktionsgemisch in diese Vertiefung. Legen Sie einen Lateral-Flow-Papierstreifen in jede Vertiefung und warten Sie, bis die Flüssigkeit die Oberseite des Streifens erreicht.Die chemisch modifizierte einzelsträngige DNA zeigte eine Cas12a-Aktivierung im Vergleich zur unmodifizierten doppelsträngigen DNA und der einzelsträngigen DNA. Modifizierte DNA-Moleküle im unverarbeiteten Urin zeigten eine kolorimetrische Auslesung auf Lateral-Flow-Papierstreifen. Die führende Probenbande zeigte die Freisetzung von nachweisbarem FAM durch die durch Harn-DNA ausgelöste Reporterspaltung an.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanosensor Characterization and CRISPR-Cas Mediated Urine Biomarker Test for Cancer Diagnostics

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Forschung

Biotechnik