nanosensor characterization and crispr-cas mediated urine biomarker test for cancer diagnostics

Test dei biomarcatori delle urine sintetiche CRISPR-Cas per la diagnostica del cancro

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

Autore in primo piano: Ingegneria di strumenti molecolari per il rilevamento e l'imaging delle malattie

Test dei biomarcatori sintetici delle urine multianalitiche mediato da CRISPR-Cas per la diagnostica portatile

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

Caratterizzazione di nanosensori e test di biomarcatori urinari mediati da CRISPR-Cas per la diagnostica del cancro

Per iniziare, sciogliere due milligrammi di PEG multivalente con il gruppo reattivo della maleimmide e un millilitro di tampone fosfato da 100 millimolari. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri. Aggiungere alla soluzione i coniugati peptidici del DNA terminati con cisteina.Utilizzare la cromatografia ad esclusione dimensionale per rimuovere i materiali non coniugati. Eseguire gli esempi in PBS. Monitorare l'assorbanza del per rilevare DNA e peptidi.Posizionare il campione nelle provette del filtro centrifugo e concentrare i nanosensori sintetizzati mediante centrifugazione secondo la velocità consigliata dal produttore. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti come base per una camera di alloggiamento personalizzata. Per raccogliere l'urina per le misurazioni di base, posizionare prima un topo nella camera dell'alloggiamento.Applicare una leggera pressione sulla vescica del topo trattenuto per espellere l'urina residua sulla piastra. Pipettare l'urina raccolta in una provetta da 1,5 millilitri. Preparare 200 microlitri della soluzione iniettabile del nanosensore in PBS sterile.Iniettare per via endovenosa 200 microlitri di soluzione in ciascun topo. Dopo un'ora di iniezione, raccogliere i campioni di urina dai topi di controllo e sperimentali. Per il rilevamento CRISPR basato sulla fluorescenza dei codici a barre del DNA, centrifugare i campioni di urina a 800 G per cinque minuti a temperatura ambiente.Ora combina i reagenti CRISPR, quindi aggiungi l'enzima Cas12a prima di pipettare delicatamente la miscela di reazione su e giù. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi eseguire la reazione reporter utilizzando la miscela di DNA reporter basata su FRET.Aggiungere la miscela a una piastra da 384 pozzetti e misurare immediatamente la fluorescenza a 37 gradi Celsius ogni due minuti per tre ore per monitorare la cinetica di scissione. Per eseguire il rilevamento CRISPR su carta, eseguire una reazione reporter alternativa dopo l'incubazione della reazione CRISPR utilizzando un reporter di DNA marcato con FAM-Biotina. Dopo aver combinato i reagenti in una piastra a 96 pozzetti, coprirla con un foglio di alluminio, quindi posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Ora aggiungi 80 microlitri di PBS in un nuovo pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Pipettare 20 microlitri di miscela di reazione reporter in questo pozzetto. Posizionare una striscia di carta a flusso laterale su ciascun pozzetto e attendere che il liquido raggiunga la parte superiore della striscia.Il DNA a singolo filamento chimicamente modificato ha dimostrato l'attivazione di Cas12a rispetto al DNA a doppio filamento non modificato e al DNA a singolo filamento. Le molecole di DNA modificate nelle urine non trattate hanno mostrato una lettura colorimetrica su strisce di carta a flusso laterale. La banda principale del campione ha indicato il rilascio di FAM rilevabile attraverso la scissione del reporter innescata dal DNA urinario.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanosensor Characterization and CRISPR-Cas Mediated Urine Biomarker Test for Cancer Diagnostics

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Ricerca

Bioingegneria