nanosensor characterization and crispr-cas mediated urine biomarker test for cancer diagnostics

Kanser Teşhisi için CRISPR-Cas Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

Yazar Spotlight: Hastalık Tespiti ve Görüntüleme için Mühendislik Moleküler Araçları

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

Kanser Teşhisi için Nanosensör Karakterizasyonu ve CRISPR-Cas Aracılı İdrar Biyobelirteç Testi

Başlamak için, iki miligram çok değerlikli PEG'yi maleimid reaktif grubu ve bir mililitre 100 milimolar fosfat tamponu ile çözün. Çözeltiyi 0.2 mikrometrelik bir filtreden süzün. Çözeltiye sistein sonlandırılmış DNA peptit konjugatlarını ekleyin.Konjuge olmayan malzemeleri çıkarmak için boyut dışlama kromatografisini kullanın. Örnekleri PBS'de çalıştırın. DNA ve peptitleri tespit etmek için absorbansını izleyin.Numuneyi santrifüj filtre tüplerine yerleştirin ve sentezlenen nanosensörleri üreticinin tavsiye ettiği hıza göre santrifüjleme yoluyla konsantre edin. Özelleştirilmiş bir muhafaza odası için taban olarak 96 oyuklu bir plaka kullanın. Temel ölçümler için idrarı toplamak için, önce muhafaza odasına bir fare yerleştirin.Kalan idrarı plakaya atmak için kısıtlanmış farenin mesanesine hafif bir baskı uygulayın. Toplanan idrarı 1,5 mililitrelik bir tüpe pipetleyin. Steril PBS'de 200 mikrolitre nanosensör enjeksiyon solüsyonu hazırlayın.Her fareye intravenöz olarak 200 mikrolitre çözelti enjekte edin. Bir saatlik enjeksiyondan sonra, idrar örneklerini kontrol ve deney farelerinden toplayın. DNA barkodlarının floresan tabanlı CRISPR tespiti için, idrar örneklerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 G'de santrifüjleyin.Şimdi CRISPR reaktiflerini birleştirin, ardından reaksiyon karışımını yukarı ve aşağı hafifçe pipetlemeden önce Cas12a enzimini ekleyin. Reaksiyon karışımını 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, FRET tabanlı raportör DNA karışımını kullanarak raportör reaksiyonunu çalıştırın.Karışımı 384 oyuklu bir plakaya ekleyin ve bölünme kinetiğini izlemek için floresansı üç saat boyunca her iki dakikada bir 37 santigrat derecede ölçün. Kağıt tabanlı CRISPR tespiti yapmak için, FAM-Biotin etiketli bir DNA raportörü kullanarak CRISPR reaksiyonunun inkübasyonunu takiben alternatif bir raportör reaksiyonu çalıştırın. Reaktifleri 96 oyuklu bir plakada birleştirdikten sonra, alüminyum folyo ile örtün, ardından plakayı 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.Şimdi 80 mikrolitre PBS'yi 96 oyuklu bir plakanın taze bir kuyusuna ekleyin. Bu kuyucuğa 20 mikrolitre raportör reaksiyon karışımını pipetleyin. Her oyuğa bir yanal akışlı kağıt şerit yerleştirin ve sıvı şeridin tepesine ulaşana kadar bekleyin.Kimyasal olarak modifiye edilmiş tek sarmallı DNA, değiştirilmemiş çift sarmallı DNA ve tek sarmallı DNA'ya göre Cas12a aktivasyonu gösterdi. İşlenmemiş idrardaki modifiye DNA molekülleri, yanal akışlı kağıt şeritler üzerinde kolorimetrik okuma gösterdi. Önde gelen numune bandı, idrar DNA'sı tarafından tetiklenen raportör bölünmesi yoluyla saptanabilir FAM salınımını gösterdi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanosensor Characterization and CRISPR-Cas Mediated Urine Biomarker Test for Cancer Diagnostics

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Biyomühendislik