Purification des cellules endothéliales lymphatiques murines

Pour purifier les cellules endothéliales lymphatiques de l’urine, utilisez des cellules isolées du derme murin après qu’elles aient atteint environ 80 à 90 % de co-fluidité, commencez par laver les billes magnétiques précodées dans un séparateur magnétique à l’aide d’un millilitre de solution de revêtement de billes magnétiques. Remettre les billes en suspension dans 150 microlitres de DMEM contenant 0,1% BSA. Ensuite, lavez deux fois les cellules de la plaque de culture tissulaire de 60 millimètres avec du PBS.

Mélangez 50 microlitres de billes conjuguées d’anticorps avec trois millilitres de DMEM contenant 0,1% BSA et ajoutez-le aux cellules. Scellez le plat avec du biofilm, puis incubez le plat sur un shaker en agitant à 10 tr/min à température ambiante pendant exactement 10 minutes. Jetez le milieu avant de laver les cellules une fois avec du PBS.

Inspectez rapidement les cellules pour vérifier la présence de colonies de LEC sur la plaque. Ajoutez un millilitre de tripsine EDTA aux cellules et incubez pendant trois minutes à 37 degrés Celsius pour essayer de remplir les cellules. Inspectez les cellules pour vous assurer que le détachement des cellules est réussi.

Après avoir neutralisé la solution avec deux millilitres de média LEC complet. Transférez la solution cellulaire dans un tube stérile en polypropylène de cinq millilitres. À l’aide d’un séparateur magnétique, lavez les cellules avec trois millilitres de DMEM contenant 0,1 % de BSA pour éliminer les cellules non liées.

Remettez en suspension les cellules restantes liées aux billes dans un milieu LEC complet et plaquez-les sur des plaques de culture tissulaire de 60 millimètres recouvertes de collagène. L’imagerie en fond clair et en fluorescence a facilement permis d’identifier les cellules endothéliales lymphatiques positives de LYVE1 après purification et a montré que plusieurs billes y étaient attachées. Les cellules présentaient une faible confluence 24 heures après la purification, alors qu’elles étaient fortement cofluentes, sept jours après la purification.