stromal cell extraction from mouse bone and bone marrow for superior single cell multi&#45;omics data

Optimalisering av stromalcelleisolering fra thymus og benmarg

In the healthy adult, de novo production of blood cells occurs in the bone marrow and the thymus. Stromal cells at these sites are essential for maintenance of hematopoiesis, but stroma constitutes less than 1% of the tissue1,2,3,4. Obtaining pure isolates of hematopoiesis supporting stroma therefore constitutes a significant challenge, particularly for single-cell multiomics that requires expedient processing to obtain samples of high quality. Components of different digestion cocktails may interfere with certain steps in multiomics analysis5,6. The protocols presented here detail the isolation of a wide variety of stromal cells from bone marrow and thymic tissues.
Perturbations of stromal constituents in both bone marrow and thymus result in profound disruption in blood cell development and can result in malignancies7,8,9. Hematopoiesis supporting stroma is damaged following cytotoxic conditioning and bone marrow transplantation, resulting in reduced secretion of cytokines and growth factors that sustain hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs)2,10,11. Furthermore, aging affects bone marrow and thymus stromal cells likely contributing to aged hematopoietic phenotypes. The thymus is the first organ to undergo extensive age-associated involution. Fat and fibrotic tissue start replacing T cell supportive stroma as early as the onset of puberty12,13. In the bone marrow, adipocyte content increases with age and the vascular and endosteal niches are significantly remodeled14,15,16.
To enable study of hematopoiesis supportive stroma across multiple stress states and in the case of the thymus of both human and murine tissue, we have optimized previously published digestion protocols1,2,8,17,18. These protocols ensure efficient and reproducible isolation of cells, and they are compatible with single-cell RNAsequencing (scRNAseq) and other types of multiomics.

Forfatter i søkelyset: Fremme hematopoietisk forskning ved bruk av stromalcelleisolering for enkeltcellesekvensering

Stromal celleisolering fra hematopoietiske organer

Development of hematic cells in bone marrow and thymus is highly dependent on stromal cells for support. Perturbations of hematopoietic stromal cell function can lead to inefficient or even malignant blood production. Our lab is focused on understanding stromal cell regulation of hematopoiesis and how it can be manipulated for therapeutic benefits.The advent of single cell sequencing has driven a cascade of recent advances in many research fields. This is also the case in our field where single cell resolution has enabled the identification of heterogeneous stromal cell populations in hematopoietic organs that were previously unknown. Our protocols are optimized to address this, and we hope they will enable more research on stromal cells to tackle critical questions in the field.

Stromal celleekstraksjon fra musebein og benmarg for overlegne encellede multi-omics-data

For å begynne, ta lårbenet, tibia, bekkenet og humerusbenene isolert fra en mus. Bruk en skalpell til å skjære gjennom vekstplatene til lange bein, og fjern epifysen. Legg den i en 10 centimeter tallerken med M199 medium pluss 2 % FBS på is.Deretter bruker du en 28-gauge nål og en 10-milliliters sprøyte fylt med M199 medium pluss 2 % FBS for å skylle margen inn i et 15-milliliters rør på is. Plasser det spylte beinet i fatet med epifysen. La 15-milliliters røret stå oppreist på is til margen legger seg.Fjern deretter M199-mediet pluss 2 %FBS Tilsett fire milliliter av B&M-dissosiasjonscocktailen til 15-millilitersrøret og inkuber i et vannbad på 37 grader Celsius. Etter inkubasjon, samle supernatanten og filtrer gjennom en 70 mikrometer cellesil inn i et kaldt 50 milliliters rør. Tilsett to milliliter fersk B&M-dissosiasjonscocktail til den gjenværende benmargspelleten og sett den tilbake i vannbadet.Bruk en pipette på én milliliter til å pipettere eventuelle gjenværende benmargsbiter kraftig. Samle all cellesuspensjon i samme rør som før. Tilsett 20 milliliter M199-medium med 0,5 % BSA, og to-millimolar EDTA til cellesuspensjonen.Etterpå sentrifugerer du cellene ved 500 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Resuspender pelleten i 500 mikroliter PBS med 0.5% BSA og biotinantistoffer. Inkuber på en orbital shaker i 10 minutter ved romtemperatur i mørket.Deretter virvler du de magnetiske perlene grundig. Tilsett 25 mikroliter av perlene i røret og inkuber igjen på orbitalristeren. Plasser røret i en matchende magnet i to til tre minutter og samle supernatanten i et nytt rør.Bryt beinene i mindre biter i den 10 centimeter store fatet ved hjelp av den flate enden av et 50 milliliters rør. Filtrer supernatanten gjennom en 70 mikrometer cellesil for å isolere beinfragmenter. Skjær beinfragmentene i cellesilen med saks.Plasser filteret med beinfragmentene på et 50 ml rør og åpne filteret med skalpellen. Overfør beinfraksjonen med en pinsett til fem milliliter murin B&M-dissosiasjonsblanding. Plasser deretter røret horisontalt i et vannbad på 37 grader Celsius med 120 RPM risting i 30 minutter.Etter fordøyelsen, tilsett 25 ml M199-medium med 0,5 % BSA og to-millimolar EDTA. Filtrer supernatanten som inneholder stromale celler gjennom en 70-mikron cellesil inn i et kaldt 50-milliliters rør.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stromal Cell Extraction from Mouse Bone and Bone Marrow for Superior Single Cell Multi&#45;Omics Data

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Isolation of Stromal Cells from Murine Thymic Tissue for Generating High&#45;Quality Single Cell Multiomics Datasets

Isolering av stromaceller fra murine thymusvev for generering av høykvalitets enkeltcelle multiomics-datasett