flow cytometry procedure to measure relative ph of the glycosome in living trypanosoma brucei

Utveckling av pHluorin2-baserad sensor för glykosomalt pH i Trypanosoma brucei

Parasitic kinetoplastids, like most living organisms, rely on glucose as a fundamental component of central carbon metabolism. This group includes medically important organisms, such as the African trypanosome, Trypanosoma brucei; the American trypanosome, T. cruzi; and parasites of the genus Leishmania. Glucose metabolism is critical to parasite growth in the pathogenic lifecycle stages. For example, when deprived of glucose, the bloodstream form (BSF) of the African trypanosome dies rapidly. Notably, glycolysis serves as the sole source of ATP during this stage of infection1. Leishmania&#160;parasites are likewise dependent on glucose in the human host, with the amastigote lifecycle stage that resides in host macrophages reliant on this carbon source for growth2.
While these parasites have distinct lifestyles involving different insect vectors, they share many commonalities in how they respond to and consume glucose. For example, these parasites localize most glycolytic enzymes into modified peroxisomes called glycosomes. This kinetoplastid-specific organelle is related to mammalian peroxisomes based on conserved biosynthetic mechanisms and morphology3,4,5,6.
The compartmentalization of most of the glycolytic pathway enzymes into the glycosome offers parasite-specific means of regulation of the pathway. Using a chemical pH probe, we established that nutrient deprivation triggers a rapid acidification of procyclic form (PF) parasite glycosomes that results in altered glycolytic enzyme activity through exposure of an allosteric regulator binding site on the key glycolytic enzyme hexokinase7,8. In our previous work, the chemical probe required constant delivery for use, limiting its utility in other applications. Additionally, challenges maintaining the probe distribution in the glycosome in the BSF limited the utility of the approach for investigating glycosomal pH in that life stage.
In this study, we have used the fluorescent protein biosensor pHluorin2 to monitor glycosomal pH change in BSF T. brucei in response to environmental cues including glucose starvation9 (Figure 1). Results from this work suggest that BSF T. brucei acidifies glycosomes rapidly in response to starvation in a reversible fashion, similar to responses we have observed in PF parasites. We expect this biosensor will improve our understanding of glycolytic regulation in T. brucei and related parasites.

Författare Spotlight: Framsteg inom glykosomal pH-övervakning i Trypanosoma brucei med hjälp av pHluorin2 Biosensor

Mätning av dynamiska glykosomala pH-förändringar i levande Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for Trypanosoma brucei, yet little is known about how the cells sense and respond to changing glucose levels in the environment. We have developed parasites expressing a pH biosensor that allows us to monitor glycosomal pH in live parasites, which will aid in the understanding of parasites'dynamic responses to nutrient fluctuation. A challenge for this experiment would be the availability of a flow cytometer equipped with a microtiter plate reader, as well as the appropriate filter sets to measure biosensor fluorescence.Additionally, T.brucei is a risk group two organism, so the cytometer must be housed within a biosafety level two facility. It has been discovered that the pH level of glycosomes can affect glycolysis as hexokinase and phosphofructokinase are pH sensitive. However, the pH probes that were previously used did not accurately target to the glycosome in the bloodstream form.A better tool was needed to study the relationship between glycosomal pH and glycolysis in this parasite life stage. The pHluorin2-PTS1 sensor is a tool that is better at localizing to the glycosome than chemical pH probes in this life stage. It's user friendly, as you only need to induce expression of the pH sensor overnight, and the cells will make and localize pHluorin2 to the glycosome.Using flow cytometry to measure pHluorin2 increases throughput and improves statistical measurements compared to microscopy.

Flödescytometriprocedur för att mäta glykosomens relativa pH i levande Trypanosoma brucei

Börja med att starta flödescytometerns programvara. Öppna ett nytt experiment. Lägg till önskat antal exempel och namnge dem.Ställ sedan in ett YL2-H- eller RL1-H-kanalhistogram, ett punktdiagram för framåtspridningsområde kontra sidospridningsområde, ett punktdiagram för framåtspridningsområde kontra framåtspridningshöjd och ett punktdiagram för BL1-H kontra VL2-H-kanal. Placera de ofärgade kontrollcellerna av vildtyp Trypanosoma brucei på sample injektionsport och justera stage position. Om du vill minska filstorleken avmarkerar du de kanaler som inte är avsedda att spelas in.Börja med låg flödeshastighet för att möjliggöra justeringar. Klicka sedan på Kör för att påbörja datainsamlingen. Finjustera YL2- eller RL1-spänningen för att rikta in huvudtoppen inom 10 till den tredje till 10 till den fjärde relativa fluorescensintensitetsenheterna.Justera spridnings- och sidospridningsspänningarna framåt för att säkerställa att mer än 90 % av händelserna ligger inom punktdiagrammets intervall. Ställ in tröskelvärdet för framåtspridning för att utesluta skräp utan att utelämna livskraftiga celler. Ändra VL 2- och BL 1-kanalinställningarna för att placera den primära toppen av den ofärgade vildtypskontrollen inom 10 till de två till 10 till de fjärde relativa fluorescensintensitetsenheterna.Klicka på Spela in och mät minst 10 000 händelser. Placera sedan det första inducerade pHluorin-uttryckande trypanosomprovet färgat med antingen propidiumjodid eller tiazolrött på provinjektionsporten. Återigen, starta datainsamlingen med låg flödeshastighet efter att ha utfört sköljningen.Övervaka varje diagram för att säkerställa att mer än 90 % av händelserna fångas korrekt och att VL2-H- och BL1-H-kanalerna inte är mättade. Spara data från varje exempel i FCS-filformat och förbered för analys.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Procedure to Measure Relative pH of the Glycosome in Living Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Sample Preparation for Flow Cytometry to Measure pHluorin2 Fluorescence in Living Trypanosoma brucei

Provberedning för flödescytometri för att mäta pHluorin2-fluorescens hos levande Trypanosoma brucei

Analysis of Flow Cytometry Data to Measure the Relative pH of the Glycosome in Living Trypanosoma brucei

Analys av flödescytometridata för att mäta glykosomens relativa pH i levande Trypanosoma brucei