Till att börja med tar du den nyligen isolerade äggstockscancervävnaden. Tvätta den färska servetten i en petriskål noggrant med PBS utan kalcium och magnesium. Använd engångsskalpeller och sax för att dela vävnaden i petriskålen i små bitar.
Samla vävnaden i kryogena rör. Överför sedan dessa rör till en behållare fylld med flytande kväve för chockfrysning. Samla sedan vävnad som mäter två till tre millimeter i en histologisk provbehållare och fixera sedan vävnaden i en formalinbehållare i 24 timmar.
Använd en skalpell för att homogenisera vävnaden före enzymatisk matsmältning för att maximera mekanisk dissociation. Inkubera sedan i ett vattenbad vid 37 grader Celsius i 1,5 timme. Efter inkubationen, tillsätt 15 ml kallt basalodlingsmedium i röret.
Centrifugera röret i fem minuter vid 300 G, ta bort supernatanten och tillsätt fem milliliter nytt basalodlingsmedium. Sila sedan cellsuspensionen med ett 400 mikrometerfilter i ett nytt 15 ml-rör. För att eliminera erytrocyter, tillsätt fem milliliter lyseringsbuffert för röda blodkroppar till cellpelleten och inkubera i ett vattenbad i fem minuter vid 37 grader Celsius.
Efter inkubationen, tillsätt fem milliliter basalmedium för lysinaktivering. Pelletera cellerna genom centrifugering och tillsätt tre milliliter basalodlingsmedium till cellpelleten. Överför nu det erforderliga antalet celler suspenderade i basalodlingsmediet till ett nytt rör.
Centrifugera cellerna och efter att ha kasserat supernatanten, blanda cellpelleten med kall BME 2-matris noggrant på is. Frö cellerna i droppar av BME 2-matris på en förvärmd, tom 48-hålsplatta medan du pipetterar däremellan för att säkerställa jämn fördelning. Tillsätt sedan 250 mikroliter av varje äggstockscancermedium i motsvarande brunnar.
För att starta en 2D-odling från de återstående isolerade cellerna, centrifugera cellerna i fem minuter vid 300 G och tillsätt cellpelleten till 2D-mediet. Använd ett faskontrastmikroskop för högkvalitativa bilder av både 2D- och 3D-kulturer, samt direkta seende plattor. Avbilda plattan under 4X-objektiv för en översikt över brunnarna och under 10X- och 20X-objektiv för att dokumentera organoidmorfologi.
Organisera och lagra bilderna i mappar som är avsedda för enskilda rader. Cirka 14 till 21 dagar efter isolering, utvärdera organoidbildningspotentialen, inklusive kvantitet, storlek och cellulär fenotyp. Leta efter specifika egenskaper som frånvaro av vakuoler, membranblabbing, förlust av vidhäftning och avrundning av celler.
Organoidlinjer genererades framgångsrikt från olika histologiska typer och stadier av äggstockscancer, inklusive primära höggradiga serösa, post-neoadjuvanta intervalloperationer och återkommande sjukdomar.