시작하려면 멸균 폴리스티렌 또는 유리 배양 튜브에서 5ml의 Luria-Bertani 또는 LB 배지로 대장균을 배양합니다. 섭씨 37도에서 200RPM으로 흔들면서 밤새 튜브를 배양합니다. 서브컬쳐: 원뿔형 플라스크에서 100밀리리터 LB에 1-50 하룻밤 동안 재배된 배양물.
섭씨 37도, 200RPM에서 약 1.5시간 동안 배양액을 배양합니다. 다음으로, 100 마이크로 리터의 높은 역가 T4 파지 스톡을 대장균 배양액에 넣고 섭씨 37도에서 3 시간 동안 흔들어 배양합니다. T4 파지 용해물이 투명해지면 50밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다.
4, 20 분 동안 000 g에 용해물을 분리하기 위하여 어떤 남아 있는 박테리아 및 세포질 파편든지 펠릿하기 위하여 분리한다. 0.22 미크론 나일론 필터를 사용하여 생성된 상층액을 여과 멸균하고 여과액을 새로운 50밀리리터 튜브로 수집합니다. 여과된 T4 파지 용해물에 0.1부피의 클로로포름을 추가하여 나머지 박테리아를 죽이고 박테리아 성장을 방지합니다.
잠깐 와류하고 실온에서 10분 동안 용해물을 배양합니다. 용해물에서 클로로포름을 분리하기 위해 4, 5분 동안 000g에서 용해물을 원심분리한다. 혈청학적 피펫을 사용하여 상단 용해물 층을 새 50밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
13킬로달톤 원심 필터 장치의 상부 저장소에 100밀리리터의 파지 용해물을 추가합니다. 용해물을 4, 000 g에 5 분 동안, 또는 용해물의 대부분이 여과기를 통과할 때까지 집중시키십시오. P200 또는 P1000 피펫을 사용하여 상부 저장소 내에서 나머지 2mL의 용해물을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 필터 멤브레인의 막힘을 풉니다.
하부 저장소의 여과액을 폐기물 용기에 버리십시오. 농축을 반복하고 상부 저장소에 약 2ml의 농축된 파지를 유지합니다. 마지막 회전 후 상부 저장소에서 남은 용해물을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
파지 용해물을 세척하기 위하여는, 위 공기통에 식염수 마그네슘, 또는 SM의 완충기의 12 밀리리터를 추가하고, 4에 원심분리기, 10 분 동안 000 g. 두 번째 세척 후 SM 완충액에 남아 있는 2밀리리터의 용해물을 최종 부피 10밀리리터로 재현탁시킵니다. 용해물을 50밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 보관합니다.
오염된 내독소를 제거하려면 용해물의 총 부피에 0.4부피의 1-옥탄올을 추가합니다. 튜브의 뚜껑을 밀봉 필름으로 밀봉하고 120RPM으로 1시간 동안 흔든 후 섭씨 4도에서 흔들지 않고 1.5시간 동안 배양합니다. 내독소가 제거된 용해물을 1-옥탄올에서 분리하기 위한 원심분리기.
P1000 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 양의 1-옥탄올을 조심스럽게 제거하고 적절한 폐기물 용기에 폐기합니다. 18게이지 바늘과 10밀리리터 주사기를 사용하여 나머지 1-옥탄올 층 아래에 있는 파지 용해물을 수집합니다. T4 파지 용해물 1mL 분취액을 멸균 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다.
속도 진공 뚜껑을 가진 관은 4, 000 g에 용해물에서 잔여 1-Octanol를 증발하기 위하여 열린다. 파지 용해물을 10의 계수로 연속 희석한 다음 각 희석액의 5마이크로리터를 LB 한천 플레이트에 배치하고 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 플라크를 세어 플라크 형성 단위(PFU)를 계산합니다.
생성된 용해물과 SM 완충액을 원하는 농도로 희석하고 다시 연결하여 확인합니다. 농축 용해물을 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.
