합성 세포 응용을 위한 소형 단층 소포(SUV)를 사용한 벌크 셀 프리 발현 반응

먼저 POPC 지질이 들어 있는 유리 바이알에 아르곤을 부드럽게 불어넣고 바이알을 부드럽게 회전시킵니다. 지질이 바이알 바닥에서 필름으로 건조되면 뚜껑을 느슨하게 닫은 다음 건조기로 옮깁니다. 1시간 후 0.5mL의 초순수 탈이온수를 첨가하여 지질막을 용해시킵니다.

2분 동안 용액을 소용돌이치게 합니다. 다음으로, 두 개의 필터 지지대와 탈이온수를 담뱉습니다. 각 내부 멤브레인 지지대에 놓습니다.

그런 다음 압출기 외부 케이싱과 리테이너 너트로 함께 고정된 두 개의 내부 멤브레인 지지대 사이에 100나노미터 폴리카보네이트 필터를 놓습니다. 압출기 스탠드에 설정을 놓고 미니 압출 장치 설정을 마칩니다. 다음으로, 지질 물 혼합물을 1 밀리리터 gast 타이트 주사기에 넣으십시오.

스윙 암 클립을 사용하여 주사기를 미니 압출기의 한쪽 끝에 고정합니다. 두 번째 주사기를 미니 압출기의 다른 쪽 끝에 삽입하고 완전히 눌렸는지 확인합니다. 이제 원래 주사기의 지질 물 혼합물을 장치를 통해 빈 주사기로 통과시킵니다.

압출을 11회 반복한 후 SUV를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. cell-free expression protocol을 조립하기 위해 용해성 SFGFP 또는 글루타메이트 수용체 SFGFP, murine RNAse 및 SUV 용액의 변이체에 대한 1-3 DNA 플라스미드 인코딩을 바이알에 결합합니다. 초순수 탈이온수를 추가하여 반응 부피를 20마이크로리터로 만듭니다.

cell-free expression 용액을 96웰 원뿔형 V 바닥판으로 옮깁니다. 섭씨 37도의 플레이트 리더에서 4-5시간 동안 플레이트를 배양합니다. 플레이트 리더를 100의 게인, 485나노미터의 여기, 528나노미터의 방출, 5시간의 런타임, 2분마다 1번의 판독으로 설정합니다.

2분마다 GFP 신호를 측정하여 cell-free 반응을 실시간으로 모니터링합니다. 가용성 SFGFP는 세 가지 단백질 중에서 가장 높은 발현을 가졌습니다.