fluorescence micropipette aspiration assay to study live cell rbc mechanosensing

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Study Live Cell RBC Mechanosensing

Per iniziare, usa una matita diamantata per dividere un vetrino standard in tre strisce uguali. Usa il grasso sottovuoto per incollare un pezzo della striscia di scivolamento della copertura sul fondo di un supporto per camera fatto in casa. Allo stesso modo, fissare il secondo pezzo della striscia di scorrimento del coperchio alla parte superiore del supporto della camera.Successivamente, utilizzare una pistola per pipette per iniettare 200 microlitri della sospensione RBC etichettata tra i due vetrini di copertura. Per assemblare la configurazione di aspirazione della micropipetta, montare la camera cellulare sul tavolino di supporto su una piattaforma per microscopio. Regolare la posizione della camera fino a quando non si trova direttamente sotto l'obiettivo.Ora abbassa il supporto fino a quando non è al di sotto del livello del fluido del serbatoio dell'acqua collegato. Iniettare acqua demineralizzata nella micropipetta, quindi utilizzare una siringa dotata di un ago calibro 34 per rimuovere eventuali bolle d'aria. Svitare a metà l'estremità del supporto della micropipetta e lasciare gocciolare l'acqua dal supporto per alcuni secondi.Quindi, inserire la micropipetta riempita di sospensione nel puntale del supporto e serrare la vite del supporto. Posizionare la micropipetta nella camera cellulare. Quindi, individuare la pipetta e i globuli rossi al microscopio.Abbassare il puntale della pipetta per assicurarsi che sia livellato con l'RBC individuato. Regolare l'altezza del serbatoio dell'acqua per azzerare la pressione idraulica sulla punta. Quindi, sollevare leggermente il serbatoio dell'acqua per generare una leggera pressione positiva.Accendere la sorgente luminosa di eccitazione fluorescente a 488 nanometri. Accendere la fotocamera fluorescente e la fotocamera trasmessa. Immettere il tempo di esposizione, l'area di interesse e la dimensione del binning per entrambe le fotocamere nel software corrispondente.Quindi, impostare il numero di acquisizione su 2000 nel pannello Acquisizione multidimensionale. Scegliere la directory di salvataggio desiderata. Quindi, individua la micropipetta con l'aiuto del micromanipolatore.Accendere la pressione pneumatica clamp e assicurarsi che la scatola di controllo sia in modalità esterna. Ruotare lentamente la manopola per compensare l'eventuale pressione di offset all'interno del sistema. Avviare il software che controlla la morsa pneumatica.Utilizzare il pannello di controllo elettrico per mantenere la pressione controllata con un fattore di conversione del mercurio di 20 millivolt per millimetro. A questo punto, azzerare la pressione all'interno del sistema, quindi riposizionare con cautela la micropipetta vicino ai globuli rossi. Regolare la posizione del serbatoio dell'acqua per generare una leggera pressione positiva sulla punta della micropipetta.Avviare l'acquisizione nel software della fotocamera e attivare l'otturatore a fluorescenza. Digitare l'entità della tensione calcolata nel pannello di controllo per raggiungere la pressione desiderata e aspirare un RBC. Mantenere la pressione per un periodo prestabilito, quindi rilasciarla.Allo stesso modo, ripeti l'esperimento con il globulo rosso successivo prima di ulteriori analisi. L'aumento incrementale della pressione ha provocato una maggiore mobilizzazione degli ioni calcio nei globuli rossi.

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Cell Mechanobiology Using Fluorescence Micropipette Aspiration

Author Spotlight: Advancing Live-Cell Mechanobiology Through Fluorescence Microaspiration

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...

Ricerca

Biologia

Fabrication of Micropipettes for Fluorescence Aspiration Assay to Study Live Cell RBC Mechanosensing