Pour commencer, connectez l’imprimante 3D à un ordinateur. Chargez une seringue jetable d’un millilitre avec une aiguille dans les pinces imprimées en 3D. Utilisez deux boulons à douille M8 pour fixer les pinces autour de la seringue.
Tournez la vis-mère pour soulever manuellement le piston, créant ainsi un espace d’air de deux millilitres dans la seringue. Pour préparer des cultures de vibrio cholerae, inoculez les cellules dans trois millilitres de bouillon Luria avec 10 billes de verre stériles. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq à six heures.
De même, inoculez E.Coli dans trois millilitres de bouillon liquide Luria. Après une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius, inoculez 200 microlitres de la culture dans du bouillon Luria frais pendant trois heures. Transférez la culture dans un tube à centrifuger de 10 millilitres.
Ensuite, centrifugez-le pendant cinq minutes à 644G à température ambiante. Maintenant, retirez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 10 microlitres de bouillon liquide Luria. Ensuite, chargez une seringue vide de trois millilitres en plastique dans la bio-imprimante 3D.
Connectez le piston de la seringue avec la vis-mère. Rétractez la seringue manuellement pour transférer l’espace d’air afin de permettre un meilleur mouvement du piston. Fixez une aiguille émoussée de taille appropriée à l’embout de la seringue.
Faites tourner manuellement la vis pour rétracter le piston de la seringue et chargez la suspension bactérienne dans la seringue. Pour préparer le mélange d’hydrogel granulaire, mélanger des granulés secs d’acide acrylique réticulé avec 400 millilitres de bouillon Lennox Luria-Bertani à 2%. Ajustez le pH à 7,4 avec des incréments de 500 microlitres d’hydroxyde de sodium de 10 molaires et testez le pH sur une bandelette de test.
Utilisez une seringue en plastique stérile de 50 millilitres pour transférer le mélange d’hydrogel dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifuger la matrice à 161 G pendant une minute à température ambiante. Ensuite, utilisez une seringue de 30 millilitres pour transférer le volume requis de la matrice dans un récipient où l’impression aura lieu.
Ensuite, placez les récipients d’échantillons avec la matrice d’hydrogel sur les supports sur la plate-forme de construction de l’imprimante. Lancez le logiciel d’impression 3D. Cliquez sur fichier, puis appuyez sur ouvrir le fichier pour charger un gcode préprogrammé dans le logiciel.
Entrez la durée du déplacement. Ensuite, déplacez les plans X, Y, Z pour centrer les têtes d’impression sur le plan X/Y. Appuyez sur l’icône d’accueil pour réajuster l’axe Z.
Tournez manuellement la vis lentement pour enfoncer le piston de la seringue jusqu’à ce qu’une petite quantité de suspension bactérienne apparaisse à l’extrémité de l’aiguille. Essuyez l’excès de suspension avec une lingette stérile jetable. Maintenant, abaissez la tête d’impression à une distance fixe dans le support hydrogel de n’importe quel récipient d’échantillon.
Cliquez sur imprimer pour lancer l’impression. Une fois l’impression terminée, fermez les récipients d’échantillons. Jetez la seringue et l’aiguille de manière appropriée.
Essuyez l’imprimante avec de l’éthanol à 70 %. Pour l’imagerie à grand champ de vision, utilisez une caméra avec un objectif zoom attaché. Imagez les cellules juste après l’impression à température ambiante.
Ensuite, transférez les échantillons dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Les différences dans la taille des pores de la matrice ne semblaient pas affecter la propagation cellulaire non modale. Cependant, les cellules modales se propagent plus rapidement dans la matrice avec des pores plus grands par rapport aux pores plus petits.
La colonie de vibrio cholerae dans des matrices d’hydrogel avec des pores plus grands se répand avec des panaches diffus lisses. Les panaches diffus étaient absents dans les cellules non modales. La colonie dans les matrices d’hydrogel avec des pores plus petits ne se propage que par des panaches rugueux de type fractal pour les cellules modales et non modales.
On a observé que les deux cellules se propageaient à des vitesses similaires pendant les 150 premières heures. Cependant, sur de plus longues périodes, certains échantillons présentaient des taux de propagation plus rapides. Une diminution de la limite d’élasticité, des modules de stockage et des modules de perte a été observée dans l’hydrogel après l’expérience.
