Bereiten Sie zunächst die Klemmhalter und Metallklammern vor. Setzen Sie passende Klemmhalter mit je einer Metallklemme in die Montagestation. Legen Sie nasse autoklavierte Papierstücke auf die Metallklammern.
Schneiden Sie das Papier mit dem Skalpell entlang der Innenränder der Klammern ab. Schneiden Sie zwei weitere kleinere Papierstücke ab und halten Sie sie feucht. Legen Sie mit einer spitzen Pinzette acht Kernexplantate auf das Papier zwischen den Metallklammern mit ihren Endpunkten auf den Klammern.
Decken Sie die Endpunkte der Kernexplantate mit kleineren Papierstücken ab und legen Sie Metallklammern darauf. Verwenden Sie einen Schraubendreher und kleine Schrauben, um die Kernexplantate zwischen den Metallklemmen und dem Klemmhalter zu befestigen. Übertragen Sie die eingespannten Kernexplantate vorsichtig in Silikonkulturkammern und füllen Sie diese Kammern mit zwei Millilitern Standard-Zellkulturmedium.
Befestigen Sie dann das Assembloid mit zusätzlichen Schrauben. Um das Kollagen-Hydrogel herzustellen, entfernen Sie zunächst Zielzellen aus Gewebekulturschalen mit einer Zellablösungslösung. Dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 400 g zentrifugieren und dann in einem Milliliter Standard-Nährmedium resuspendieren.
Bereiten Sie als Nächstes eine Vernetzungslösung vor, indem Sie 10 Mikroliter PBS, 1,28 Mikroliter NaOH und 8,72 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser pro Assembloid mischen. Fügen Sie die Zellsuspension von bis zu 12 Assembloiden hinzu und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Die Zellsuspension wird so eingestellt, dass die folgenden Endkonzentrationen erreicht werden.
Bereiten Sie separat eine Kollagen-Eins-Lösung vor, indem Sie 80 Mikroliter Kollagen hinzufügen, einen pro Assembloid, und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Sobald die Lösungen auf Eis fertig sind, saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Kammern mit den geklemmten Kernexplantaten an. Fügen Sie der Vernetzungslösung Kollagen eine Lösung hinzu und mischen Sie durch schnelles Pipettieren, ohne Blasen zu bilden.
Geben Sie 200 Mikroliter der gemischten Lösung in die Rillen in den Silikonkammern, um einzelne Sehnenkernexplantate abzudecken. Lassen Sie die Hydrogele 50 Minuten bei 37 Grad Celsius polymerisieren. Anschließend füllen Sie die Silikonkulturkammern vorsichtig mit 1,5 Millilitern des jeweiligen Co-Kulturmediums, indem Sie es in die Ecken der Kammern pipettieren.
Legen Sie die Kammern in eine große Petrischale oder eine sterile Box, bevor Sie sie in einen Inkubator legen. Die Assembloide werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert, wobei das Nährmedium zweimal pro Woche gewechselt wird. Entfernen Sie die Assembloide mit einer Schere von den Klammern.
Trennen Sie bei Bedarf mit einer Pinzette die Kernexplantate vom externen Hydrogel-Fach. Nach der Kultivierung des Assembloids unter läsionsähnlichen Kulturbedingungen über 21 Tage wurde beobachtet, dass das Kernexplantat mechanisch dehnbar, unverändert im Aussehen, visuell unterscheidbar und physikalisch vom umgebenden Hydrogel trennbar blieb. Darüber hinaus verdichtete sich das umgebende Hydrogel im Laufe der Zeit, abhängig von der ausgesäten Zellpopulation, wobei von der Achillessehne abgeleitete Fibroblasten ihr umgebendes Hydrogel am schnellsten zusammenzogen.
Die konfokalmikroskopische Beurteilung der Lebensfähigkeit, Morphologie und Zellausbreitung im 3D-Kollagenhydrogel ergab, dass die Lebensfähigkeit während der Assembloidkultur bis mindestens zum siebten Tag erhalten blieb. Darüber hinaus stieg die Genexpression von Vegfa und Mmps in Kernexplantaten stark an, wie die Transkriptomanalyse zeigte. In ähnlicher Weise wurde bei der Sekretomanalyse das Vorhandensein von Zytokinen wie dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor in den Kernexplantaten nachgewiesen.
