analysis of hsp70 chaperone activity using sds page and western blot analyses of transformed e. coli protein

Assessment of Hsp70 Chaperone Activity Using Escherichia coli dnaK756 Cells

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

ניתוח פעילות מלווה Hsp70 באמצעות SDS PAGE וניתוחי Western Blot של חלבון E. coli שעבר טרנספורמציה

כדי להתחיל, פיפטה 80 מיקרוליטר של תאי E.coli הפך בקבוקון. פיפטה 20 מיקרוליטר של פי ארבעה חיץ טעינה Laemmli SDS לתוך הבקבוקון. מרתיחים את המתלה ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בבלוק חימום.לאחר מכן לטעון 10 מיקרוליטר של המדגם על ג'ל SDS precast. אלקטרופורזה של הג'ל בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת במתח של 120 וולט במאגר הפעלה SDS. לאחר השלמת האלקטרופורזה, יש להכתים את הג'ל בכתם קומאסי למשך שעה.יש להכתים את הג'ל במאגר מעכב המכיל 50% מתנול ו-10% חומצה אצטית במים מזוקקים למשך שעתיים. הניחו את הג'ל במערכת הדמיה של ג'ל כדי להמחיש את רצועות החלבון. לאחר מכן, להעביר את החלבונים של ג'ל SDS קרום nitrocellulose.שטפו את קרום הניטרוצלולוז שלוש פעמים במאגר שטיפה. להעביר את הממברנה ל 5% חלב ללא שומן המכיל נוגדנים מדולל ליחס של אחד עד 2, 000. לדגור על הממברנה עם הנוגדנים בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב-60 סל"ד למשך שעה.לאחר מכן, שטפו את קרום הניטרוצלולוז במאגר TBS tween שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחת כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים ספציפית. עכשיו להעביר את הממברנה לצלחת עם נוגדן משני. יש לדגור על הממברנה בארבע מעלות צלזיוס תוך רעידה ב-60 סל"ד למשך שעה.לאחר שטיפת הממברנה כמו קודם, השתמש מגיב זיהוי כימילומינסנציה משופר כדי לפתור את הפסים. דמיינו את הפסים באמצעות מצלמת ג'ל.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Hsp70 Chaperone Activity Using SDS PAGE and Western Blot Analyses of Transformed E. coli Protein

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Transformation of E. coli Cells for a Complementation Assay to Assess Hsp70 Chaperone Activity

טרנספורמציה של תאי E. coli לבדיקת השלמה להערכת פעילות מלווה Hsp70