analysis of hsp70 chaperone activity using sds page and western blot analyses of transformed e. coli protein

Assessment of Hsp70 Chaperone Activity Using Escherichia coli dnaK756 Cells

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections

Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

Transforme E. coli Proteininin SDS PAGE ve Western Blot Analizleri Kullanılarak Hsp70 Şaperon Aktivitesinin Analizi

Başlamak için, 80 mikrolitre dönüştürülmüş E.coli hücresini bir şişeye pipetleyin. Şişeye 20 mikrolitre dört kez Laemmli SDS yükleme tamponu pipetleyin. Süspansiyonu bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca 100 santigrat derecede kaynatın.Ardından 10 mikrolitre numuneyi prekast bir SDS jeli üzerine yükleyin. Jeli oda sıcaklığında SDS çalışma tamponunda 120 voltta bir saat boyunca elektroforez. Elektroforez tamamlandıktan sonra, jeli bir saat boyunca Coomassie boyasında boyayın.Jeli, damıtılmış suda %50 metanol ve %10 asetik asit içeren bir leke giderici tamponda iki saat boyunca lekesini çıkarın. Protein bantlarını görselleştirmek için jeli bir jel görüntüleme sistemine yerleştirin. Daha sonra, SDS jelinin proteinlerini bir nitroselüloz membrana aktarın.Nitroselüloz membranı yıkama tamponunda üç kez yıkayın. Membranı, bir ila 2.000 oranında seyreltilmiş antikorlar içeren% 5 yağsız süte aktarın. Bir saat boyunca 60 RPM'de çalkalarken membranı dört santigrat derecede antikorlarla inkübe edin.Daha sonra, spesifik olarak bağlanmamış herhangi bir antikoru çıkarmak için nitroselüloz membranı TBS ara tamponunda her biri 15 dakika boyunca üç kez yıkayın. Şimdi zarı ikincil antikorlu bir tabağa aktarın. Bir saat boyunca 60 RPM'de çalkalarken membranı dört santigrat derecede inkübe edin.Membranı daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, bantları çözmek için gelişmiş bir kemilüminesans algılama reaktifi kullanın. Bir jel görüntüleyici kullanarak bantları görselleştirin.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Hsp70 Chaperone Activity Using SDS PAGE and Western Blot Analyses of Transformed E. coli Protein

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Biyokimya

Transformation of E. coli Cells for a Complementation Assay to Assess Hsp70 Chaperone Activity

Hsp70 Şaperon Aktivitesini Değerlendirmek için Bir Tamamlama Testi için E. coli Hücrelerinin Dönüşümü