Expansion 2D, stimulation 2D et maturation organoïde 3D de fibroblastes dermiques humains normaux adultes pour la recherche et l’ingénierie des tendons

Pour commencer, la centrifugeuse a trypsinisé des fibroblastes dermiques humains normaux. Retirez le surnageant du tube centrifugé. Ajoutez un milieu à faible teneur en glucose DMEM supplémenté préchauffé à la pastille et mélangez bien pour le remettre en suspension.

Plaquez les fibroblastes dermiques humains normaux dans une boîte de culture cellulaire adhérente de 10 centimètres. Secouez doucement le plat de manière transversale. Après 14 jours de stimulation 2D, lorsque les cellules sont devenues confluentes, aspirez le milieu et utilisez un grattoir cellulaire pour détacher doucement et rapidement la feuille cellulaire formée de la boîte.

Simultanément, roulez la feuille de cellule en un organoïde 3D en forme de bâtonnet. Transférez les organoïdes normaux de fibroblastes dermiques humains dans une boîte de Pétri non adhérente de 10 centimètres de large. Mesurez l’allongement à l’aide d’une règle.

Tenez ensuite un côté de l’organoïde à l’aide d’une pince à épiler et étirez doucement l’organoïde jusqu’à ce qu’il soit allongé axialement d’environ 10 %À l’aide d’une pince à épiler, appuyez manuellement sur les broches métalliques à travers les deux bords de l’organoïde dans le plat en plastique pour le fixer. Enfin, pour la maturation 3D, ajoutez 10 millilitres de milieu à haute teneur en glucose DMEM supplémenté préchauffé avant l’incubation. La morphologie grossière des organoïdes 3D aux jours zéro et 14 de l’étape de maturation 3D a montré un aspect blanc et scintillant.

Au fil du temps, les organoïdes se sont contractés et sont apparus plus denses. La morphologie des organoïdes a été évaluée à l’aide de la coloration HE. Le premier jour, les organoïdes ont montré des couches déconnectées, principalement composées de cellules entourées de faibles quantités de matrice.

Les cellules à l’intérieur des couches présentaient des noyaux de forme ronde et de tailles variables. Le 14e jour, une augmentation notable du signal d’éosine a été observée, ce qui indiquait un dépôt matriciel et des couches fusionnées. De plus, les organoïdes ont montré la présence de zones contenant des cellules alignées.

La majorité des noyaux avaient des tailles similaires et étaient parfois allongés.