Для начала возьмите с помощью пинцета размороженные образцы инфицированных сальмонеллой мышиных тканей. Быстро вставьте его на дно пластиковой формы, содержащей жидкую агарозу. Как только полимеризация будет завершена, используйте скальпель, чтобы открыть пластиковую форму с углов.
После установки лезвия на микротом переложите образец пальцами в перчатках в коробку для образцов. Расположите образец под микротомом так, чтобы верхняя поверхность агарозы находилась на том же уровне, что и лезвие микротома. Переместите сцену, чтобы поместить агарозный куб в центр объектива.
Нажимайте на кнопку «Разрезать» в программном обеспечении томографа до тех пор, пока не будет получен целый неповрежденный кусок куба. Затем центрируйте линзу объектива на образце ткани в направлениях x и y. Запустите программное обеспечение для лазера, отрегулируйте длину волны до 800 нанометров, а затем включите лазер.
Закройте дверцы шкафа микроскопа. Затем выключите все источники света в комнате. Включите ФЭУ и установите напряжение на 750 вольт.
Теперь установите затвор микроскопа в автоматический режим. Затем установите напряжения V1 и V2 на 20 и 1,71 соответственно. Отрегулируйте ось Z с помощью z-пьезоустройства до тех пор, пока она не достигнет поверхности ткани.
Нарежьте несколько ломтиков толщиной 50 микрометров. Далее, чтобы найти края образца, ограничьте область визуализации тканью с минимальной визуализацией окружающей агарозы. После выключения ФЭУ установите длину волны лазера на 800 нанометров.
Используйте лазерное пятно, чтобы найти координаты краев тканей во время смещения рабочей области. После подтверждения координат лазерное пятно находится справа спереди по центру. Теперь измените длину волны на 940 нанометров.
Установите затвор микроскопа в автоматический режим, затем установите напряжение затвора на 20 для V1 и 1,71 для V2. Нажмите на опцию настройки 3D Mosaic, чтобы начать сканирование. После визуализации соберите срезы тканей из резервуара с водой. Чтобы сшить плитку, изображения сначала передают данные с сервера томографа на компьютер с Linux.
Откройте скрипт MATLAB StepOneStitchingAndArchive. m и найдите исходную папку. Переключитесь на вкладку Редактор и нажмите Выполнить.
Информация о ходе выполнения будет отображаться в командном окне. Найдите сшитые изображения в подпапке stitchedimages_100 в исходной папке. Сожмите необработанные данные с помощью команды tar и сохраните их в виде одного файла с расширением tar.bz2.
Для обучения метода опорных векторов необходимо просмотреть сшитые изображения. Откройте по одному изображению с одинаковым именем файла из каждой подпапки с Fiji. Объедините три канала в одно цветное изображение, затем отрегулируйте яркость каждого канала до тех пор, пока не станут видны четкие сигналы от бактерий и автофлуоресценции тканей.
Обратите внимание на скорректированный максимальный уровень интенсивности каждого канала. Далее откройте скрипт MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m. Определите исходную папку и имена образов для обучения, затем перейдите на вкладку «Редактор» и нажмите «Выполнить».
Когда появляется диалоговое окно с запросом на цветовые пороги, заполните его значениями, основанными на предыдущей ручной проверке с Fiji. Выберите области для фона и области интереса в соответствии с диалоговыми окнами. Появятся графики, показывающие, насколько хорошо была обучена модель, и спрашивают, нужно ли добавить дополнительные регионы.
Добавляйте больше областей интереса и фона, пока бактерии не будут четко сегментированы. Процесс сегментации будет запущен автоматически, а прогресс можно будет увидеть в командном окне. Далее откройте синий канал изображения, в котором содержатся вторые гармонические сигналы коллагена.
Согните изображения первого канала в десять раз по осям X и Y и сохраните уменьшенные изображения в новой папке. Сделайте три репликации уменьшенных изображений в одной папке. Для 3D-визуализации запустите программный комплекс визуализации Imaris в окне «Арена».
Теперь откройте файл IMS или TIF. Настройте цветовое представление различных каналов в окне настройки дисплея. Нажмите «Свойства изображения» в меню «Правка», чтобы вручную установить минимальное или максимальное значение, а также значение для гамма-коррекции.
После настройки внешнего вида изображения экспортируйте текущий вид с помощью инструмента «Снимок». Используйте указатель навигации, чтобы найти представление, затем используйте плюс Добавить, чтобы добавить ключевые кадры. Используйте значок «Анимация», чтобы представить 3D-данные в виде фильма.
Нажмите красную кнопку записи, чтобы создать фильм, затем сохраните его в нужной папке назначения и типе файла. Отдельные клетки сальмонеллы были обнаружены во всех органах мыши, таких как селезенка, печень, брыжеечные лимфатические узлы и пейеровы пятна. Сегментация флуоресцентных бактерий подтверждена иммуногистохимическим методом.
Клетки-хозяева окрашивали in vivo путем введения антитела к поверхностным маркерам перед перфузией.
