Para empezar, pipetee uno o dos mililitros de solución de enjuague antiadherente en un tubo cónico de 15 mililitros. Gira el tubo para cubrir su superficie. A continuación, pipetee cinco mililitros de solución de DPBS en el tubo después de retirar la solución antiadherente.
Tape los tubos recubiertos hasta que los necesite. Pipetee cualquier medio en una placa que contenga las cúpulas de organoides intestinales humanos. Con una pipeta de un mililitro, agregue un mililitro de medio DMEM/F-12 frío a la cúpula directamente para separarla de la placa.
Pipetea otro mililitro del medio para cosechar los organoides restantes. Transfiera la suspensión a los tubos cónicos recubiertos de 15 mililitros. Pipetear la suspensión hacia arriba y hacia abajo para desintegrar los organoides hasta crear una suspensión de fragmentos uniforme con el tamaño de organoide deseado.
A continuación, pipetea una alícuota de la suspensión para contar. Coloque la suspensión restante sobre hielo. Dibuje una cuadrícula XY en la parte inferior de cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos.
Pipetear 50 microlitros de DPBS en los pocillos. Transfiera cinco microlitros de la alícuota a cada pocillo. Cuente manualmente el número total de organoides que tienen de 50 a 200 micrómetros de diámetro.
Luego use la ecuación dada para calcular el volumen de la suspensión de organoide. Después de contar los organoides, retire el sobrenadante y la capa turbia del tubo que contiene la suspensión de grupo restante. A continuación, pipetee dos mililitros de DMEM/F-12 frío directamente sobre el pellet.
Centrifugar la suspensión a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para un sistema derivado de animales, agregue 40 microlitros de pellet de organoide de matriz fría de un origen animal. Pipetea los organoides hacia arriba y hacia abajo para distribuirlos en la matriz.
Transfiera suavemente la mezcla de organoides de la matriz al centro de una placa de cultivo de tejidos estéril precalentada de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos para asegurar la gelificación de la cúpula. A continuación, pipetee 0,5 mililitros de medio de crecimiento de organoides intestinales calientes a los lados del pocillo sin perturbar la cúpula antes de la incubación.
Para el sistema de organoides libre de xeno de matriz cuatro, agregue 50 microlitros de medio de crecimiento de organoides 3X al pellet esferoide. A continuación, pipetea 100 microlitros de la matriz seleccionada con cuatro organoides libres de xeno a la suspensión. Agregue 40 microlitros de la mezcla de organoides de hidrogel al centro de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
Incuba la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, pipetee 0,5 mililitros de medio de crecimiento de organoides a lo largo de los lados del pocillo. A continuación, vuelva a incubar la placa a 37 grados centígrados con un 5% de suplementación de dióxido de carbono y un 95% de humedad.
