للبدء ، قم بإنشاء كل ركيزة مراسل وتحقق من تركيزها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. الحصول على 200 نانوغرام من الركيزة مراسل. رحلان كهربائي لكل ركيزة مراسل جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في هلام TAE 7.7٪ من الأغاروز يحتوي على صبغة الحمض النووي الفلورية المزدوجة التي تقطعت بها السبل.
تحقق من ملاحظة النطاقات المحددة بالحجم الصحيح لركيزة مراسل الوصول. في حالة تقييم تأثير المركبات على فحص المراسل ، قم بتوزيع المركبات المذابة في السيارة في آبار لوحة 96 بئرا. لتحضير مزيج النقل للوحة 96 بئرا ، قم بتخفيف بلازميد التحكم في Firefly وركيزة مراسل إصلاح كسر حبلا مزدوج NanoLuc في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنقل في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.
بعد إضافة كاشف نقل قاعدة الدهون ، دوامة خليط الحمض النووي لفترة وجيزة ، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لحصاد الخلايا ، قم بالتريبسين وإعادة تعليقها في وسط جديد يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، أو FBS. بعد ذلك ، حدد عدد الخلايا ، وأعد التعليق ثلاث مرات 10 أس ست خلايا في 8.5 ملليلتر من الوسط باستخدام FBS في أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر.
أضف مزيج نقل الحمض النووي إلى معلق الخلية واقلب الأنبوب عدة مرات للخلط. لوحة 80 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر ، واحتضان لوحة 96 بئر عند 37 درجة مئوية مع 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. قم بإعداد لوسيفيراز التحكم وكاشف لوسيفيراز المراسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
أضف الركيزة إلى حجم مناسب من المخزن المؤقت للفحص بنسبة واحد إلى 100 واخلطها. بعد أن تصل اللوحة والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 80 ميكرولترا من كاشف Firefly luciferase للتحكم لكل بئر. هز اللوحة لمدة ثلاث دقائق على شاكر مداري بسرعة 450 دورة في الدقيقة.
ضع اللوحة في قارئ لوحة التلألؤ ، وقم بقياس إشارة تلألؤ لوسيفيراز التحكم. لقياس إشارة لوسيفيراز المراسل ، أضف 80 ميكرولترا من كاشف لوسيفيراز مراسل NanoLuc لكل بئر. بعد حضانة لمدة ثلاث دقائق في شاكر مداري بسرعة 450 دورة في الدقيقة ، اترك اللوحة لترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق.
أخيرا ، قم بقياس إشارة تلألؤ لوسيفيراز المراسل في قارئ لوحة التلألؤ. أظهر تقييم مكون إشارات التلألؤ NanoLuc و Firefly أن العيب الذي تم إصلاحه كان مدفوعا بانخفاض إشارة NanoLuc ، بينما كانت إشارة التحكم في Firefly غير مضطربة.
