Name: par-clip - a method to identify transcriptome-wide the binding sites of rna binding proteins
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins at JoVE.com

Vi tackar medlemmar i Tuschl laboratorium för hjälp diskussioner. MH stöds av Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Detta arbete stöddes av det schweiziska nationella fonden Grant # 3100A0-114.001 till MZ, TT är en HHMI utredare, och arbeta i sitt laboratorium stöddes av NIH bidrag GM073047 och MH08442 och Starr Foundation.

Protokollet nedan beskriver PAR-Clip förfarande för HEK293 celler som uttrycker sjunker / HA-märkta IGF2BP1 vid induktion med doxycyklin. Vi kommer att använda en Anti-Flag antikropp för immunoprecipitation. PAR-Clip fungerar med alla cellinje som uttrycker detekterbara halter av den endogena, omärkta RNA bindande protein (RBP) av intresse om en effektiv antikropp för immunoprecipitation finns tillgänglig. Expanderande Celler <ol><li> Expandera FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 cellerna i odlingsmedium. Vi rekommenderar att du använder mellan 100-400 x 10 6 celler (ca 10 till 40 15 cm cellkultur plattor) som utgångspunkt. Odla dem till cirka 80% confluency. </li><li> 14 timmar före crosslinking lägga en) 4-thiouridine till en slutlig koncentration av 100 mikroM (1:1000 v / v av en 1 M 4-thiouridine stamlösning) direkt till cellkulturmedium och b) inducerar uttryck av flaggan / HA taggade IGF2BP1 genom tillsats av 1 mikrogram / ml av doxycyklin (1:10,000 v / v på 10 mg / ml doxycyklin stamlösning). OBS: i stället för 4-thiouridine du kan också använda 100 mikroM av 6-thioguanosine. </li></ol> UV-crosslinking <ol><li> Tvätta cellerna gång med 10 ml iskall PBS per platta och ta PBS helt. </li><li> Placera plattorna på en bricka med is och bestråla avtäckt med 0,15 J / cm 2 365 nm, UV-ljus i en Stratalinker 2400 (Stratagene) eller liknande anordning. </li><li> Skrapa celler bort med en gummi polis i 1 ml PBS per platta, transfer till 50 rör ml centrifugering och samla in genom centrifugering vid 500 xgi 5 minuter vid 4 ° C och kassera supernatanten. 100 x 10 6 HEK293-celler (10 15 cm plattor) kommer att ge ca. 1 ml av våt cellpelleten. </li><li> (Tillval) Om du inte vill fortsätta direkt med cellslys, chock frysa cellpelleten i flytande kväve och förvara vid -80 ° C. Cell pellets kan lagras i minst 12 månader. </li></ol> Cellslys och RNaseT1 smälta <ol><li> Ta upp cellpelleten av tvärbunden celler i tre volymer av 1x NP40 lyseringsbuffert och inkubera på is i 10 min. </li><li> Rensa cell lysat genom centrifugering vid 13.000 xgi 15 minuter vid 4 ° C. </li><li> Rensa lysat ytterligare genom att filtrera den genom en 0,2 ìm membran spruta filter (Pall Acrodisc eller motsvarande). </li><li> Lägg RNas T1 (Fermentas, 10000 U / l) till en slutlig koncentration av 1 U / l och inkubera i ett vattenbad under 15 minuter vid 22 ° C. Cool reaktion därefter i 5 minuter på is innan du fortsätter. </li></ol> Immunoprecipitation och återvinning av tvärbunden target RNA fragment Använda den magnetiska separatorn Följ dessa riktlinjer i hela provberedning för att förhindra att magnetiska kulor från att torka ut. <ol><li> Placera röret med pärlor på den magnetiska stå i 1 2 minuter. </li><li> Lägg bufferten till röret när röret är på den magnetiska separatorn. </li><li> Cap röret, ta bort den från den magnetiska separatorn, och suspendera pärlor. Du kan resuspendera kulorna genom att ställa röret med fingret eller använda ett vortexer inställd på 5 6. </li><li> Centrifugera kort att samla alla pärlor som kan finnas kvar i röret locket. </li><li> Upprepa steg 1 till 4 efter behov. </li></ol> Beredning av magnetiska kulor <ol><li> Överför 10 ìl Dynabeads Protein G magnetiska partiklar (Invitrogen) per ml cell lysat (för ett typiskt experiment bör det vara ca. 40 50 ìl av pärlor) till en 1,5 ml mikrofugrör. Tvätta pärlor två gånger med 1 ml av citrat-fosfat buffert. </li><li> Resuspendera i dubbelt så stor volym av citrat-fosfat buffert i förhållande till den ursprungliga volymen pärla suspension. </li><li> Tillsätt 0,25 mikrog av Anti-Flag M2 monoklonal antikropp (Sigma) per ml suspension och Inkubera på en roterande hjul för 40 minuter i rumstemperatur. </li><li> Tvätta pärlor två gånger i 1 ml av citrat-fosfat buffert för att ta bort obundna antikroppar. </li><li> Återsuspendera pärlor i två gånger volymen av citrat-fosfat buffert i förhållande till den ursprungliga volymen pärla suspension. </li></ol> Immunoprecipitation (IP), andra RNas T1 matsmältning och defosforylationen <ol><li> Tillsätt 20 l nyberedd antikropp-konjugerade magnetiska kulor per ml av partiella RNas T1 behandlas cell lysat och inkubera i 15 tuber ml centrifugering på ett roterande hjul för 1 h vid 4 ° C. </li><li> Samla magnetiska kulor på ett magnetiskt partikel samlare för 15 och 50 ml centrifugering rör (Invitrogen) och överför till 1,5 rör ml mikrofugrör. </li><li> Tvätta pärlor 3 gånger i 1 ml IP tvättbuffert. </li><li> Lägg RNaseT1 (Fermentas, 10000 U / l) till en slutlig koncentration av 100 E / l och inkubera pärla suspension i ett vattenbad under 15 minuter vid 22 ° C. Cool därefter på isi 5 min. </li><li> Tvätta pärlor 3 gånger i 1 ml av hög salt tvättbuffert. </li><li> Återsuspendera pärlor i en mängd defosforylationen buffert </li><li> Lägg kalv intestinal alkaliska fosfataser (CIAP, NEB) till en slutlig koncentration av 0,5 U / l, och inkubera suspensionen i 10 min vid 37 ° C. </li><li> Tvätta pärlor två gånger i 1 ml fosfatas tvättbuffert </li><li> Tvätta pärlor två gånger i polynucleotide kinas (PNK) buffert utan DTT (DTT-koncentration som är nödvändig för den enzymatiska reaktionen är tillräckligt hög för att skada magnetiska kulor). </li><li> Återsuspendera pärlor i ett original pärla volym PNK buffert </li></ol> Radioaktiv inmärkning av RNA segment tvärbundet till immunoprecipitated proteiner <ol><li> Till pärla fjädring som beskrivs ovan, lägg Υ-32 P-ATP till en slutlig koncentration av 0,5 μCi / l och T4 PNK (NEB) till 1 U / l i ett original pärla volym. Inkubera suspension 30 minuter vid 37 ° C. </li><li> Lägg till icke-radioaktiva ATP för att få en slutlig koncentration av 100 mikroM och inkubera i ytterligare 5 minuter vid 37 ° C. </li><li> Tvätta magnetiska kulor 5 gånger med 800 ìl PNK buffert utan DTT. </li><li> Resuspendera pärlor i 70 ìl av SDS-PAGE buffert. </li></ol> SDS-PAGE och electroelution av tvärbunden RNA-protein komplex från gelen skivor <ol><li> Inkubera radioaktivt märkt fjädring i 5 minuter i ett värmeblock vid 95 ° C att denaturera och släpp immunoprecipitated RBP med tvärbunden RNA och skaka. </li><li> Ta bort magnetiska kulor på avskiljaren och överför supernatanten till ett rent 1,5 ml mikrofugrör. </li><li> Belastning 40 l av supernatanten per brunn av en Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) prefabricerade polyakrylamidgel och kör gel för 55 min vid 200 V. </li><li> Demontera gelen kammaren och demontera gel, lämnar den monterad på en tallrik. För att underlätta anpassningen av gel till phosphorimager pappersutskrift rekommenderar vi implanterar tre små radioaktiva gel bitar asymmetriskt på tre av de fyra hörnen av gelen. Radioaktiva gel bitar kan samlas in från geler som tidigare användes för att rena radioaktivt syntetiska oligonukleotider. Linda gelen i plastfilm (t ex Saran wrap) för att undvika kontaminering. </li><li> Exponera gel till ett tomt phosphorimager skärm för 1 timme och visualisera på en phosphorimager. </li><li> Rikta in gelen ovanpå phosphorimager utskriften med implanterade gelen stycken för orientering. Skär ut band som motsvarar den förväntade storleken på RBP (IGF2BP1, ca. 75 kDa) och överför till en D-Tube dialysatorn Midi Tube och tillsätt 800 l 1x SDS löpande buffert. </li><li> Electroelute den tvärbundet RNA-RBP komplex i 1x SDS löpande buffert på 100 V för 2 h. exciderad från gel och electroeluted i en D-Tube dialysatorn Midi (Novagen) i 800 l SDS löpande buffert enligt tillverkarens anvisningar. </li></ol> Proteinas K matsmältningen <ol><li> Lägg till en lika stor volym 2x proteinas K Buffert med avseende på electroeluate, följt av tillsats av proteinas K (Roche) till en slutlig koncentration av 1,2 mg / ml. Inkubera i 30 minuter vid 55 ° C. </li><li> Återvinn RNA med sura fenol / kloroform / IAA utvinning (25:24:1, pH 4,0) följt av en kloroform extraktion. Tillsätt 1 l av glykogen (10 mg / ml lager) fällning RNA genom att lägga tre volymer av etanol. Lös upp pelleten i 10,5 l vatten. </li></ol> cDNA bibliotek beredningen och djupa sekvensering Bär återhämtade RNA genom en standard cDNA-bibliotek förberedelse protokoll ursprungligen beskrevs för kloning av små reglerande RNA 19. Det första steget, 3 &quot;adapter ligation, utfördes enligt beskrivning på en 20 l skala med hjälp av 10,5 l av det återvunna RNA. Använd Solexa sekvensering adaptern som beskrivs. Beroende på mängden av RNA som återvunnits, kan 5&#39;-adapter-3&#39;-adapter produkter utan insatser detekteras efter amplifiering av cDNA som extra PCR-band. I sådana fall punktskatter längre PCR-produkt av förväntad storlek från 3% NuSieve låg smältpunkt agarosgel, eluera PCR-produkten från gelen bitarna med GelElute kit (Qiagen) och sekvens med Solexa tekniken. Ett Solexa sekvensering köra ger vanligtvis mellan 6 och 10 miljoner sekvens läsningar som är tillräckligt för en transkriptom god täckning av bindningar på RNA bindande proteiner. Bioinformatisk analys Noggrann bioinformatiska analyser av sekvensen läser behöver göras för att få meningsfulla insikter i RNA bindningsställen för de undersökta RBP, såsom RNA erkännande elementet, den föredragna bindande regioner RBP har (exonic vs intronic, kodning sekvens vs oöversatta sekvens). Sekvensen läser måste anpassas mot det humana genomet och EST databaser. Vi använder vanligtvis läser mapping unikt att arvsmassan med upp till en obalans, införande eller borttagande att bygga kluster av serie läsningar som sedan kan ytterligare analyseras. Frekvensen av karakteristiska mutationer i klustrade sekvenserade läser, T till C övergångar när man använder 4-SU och G till A övergångar vid användning av 6-SG, vittnar om framgång tvärbundet sekvenser. Enligt vår erfarenhet uncrosslinked RNA märkta med 4-SU visar en hastighet bakgrund mutation av cirka 20%. Denna siffra har ökar till ca. 50-80% på crosslinking. En detaljerad beskrivning av de bioinformatiska analyser finns i den kompletterande material av offentliggörandet av Hafner et al. 18 Valfria steg Fastställande av bolagsordning halter av 4-thiouridine i total RNA Isolera totala RNA från cellinje stabilt uttrycker RBP intresse efter att ha ökat i medelstora kompletteras med 100 mikroM 4SU 16 h före skörd. Som en kontroll, skörd celler som odlas utan 4SU tillägg. Isolera totala RNA genom tillsats av 3 volymer av Trizol reagens (Sigma) till tvättas cellen pellets enligt tillverkarens anvisningar. ytterligare rena totala RNA med hjälp av Qiagen RNeasy enligt tillverkarens protokollet. För att förhindra oxidering av 4SU under RNA-isolering och analys, lägga 0,1 mM ditiotreitol (DTT) till tvätta buffertar och efterföljande enzymatiska steg. Smälta och defosforyleras totala RNA till enstaka nukleosider för HPLC-analys som beskrivs som tidigare 20. Kortfattat, i en 30 l volym, inkubera 40 mikrogram av renat totala RNA var för 16 h vid 37 ° C med 0,4 U bakteriell alkaliska fosfataser (Worthington Biokemisk) och 0,09 U ormgift fosfodiesteras (Worthington Biochemical). Som referens standard, använder en syntetisk 4SU-märkt RNA, (vi standardmässigt använder CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) och även av den är klar enzymatisk spjälkning. Separera de erhållna blandningarna av ribonucleosides med HPLC på en Supelco Discovery C18 (bundna fas kiseldioxid 5 mikroM partikel, 250 x 4,6 mm) omvänd fas kolumn (Bellefonte PA, USA). HPLC-buffertar är 0,1 M TEAA i 3% acetonitril (A) och 90% acetonitril i vatten (B). Använd en isokratisk lutning: 0% B i 15 min, 0 till 10% B för 20 min, 10 till 100% B för 30 min. Applicera en 5 min 100% B tvätta tillämpas mellan körningar för att rengöra i HPLC-kolonnen. Representativa resultat <img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1 (högra panelen) visar ett representativt resultat av en PAR-Clip utförs med cellinjer som uttrycker sjunker / HA-märkta IGF2BP1 med 4-SU och 6-SG. Observera att crosslinking effektiviteten i 6-SG för IGF2BP1 är lägre än crosslinking effektivitet för 4-SU. Den lägre crosslinking effektivitet kommer att resultera i en högre bakgrund av sekvenser från fragment av riklig cellulära RNA och därför bör du överväga att skala upp försöket när man använder mindre effektiv fotoreaktiva nukleosider. Den vänstra panelen i Figur 1 visar en jämförelse av att använda olika fotoreaktiva uridin analoger som kan potentiellt användas för PAR-Clip jämfört med traditionell UV 254 nm crosslinking. Intensiteten av det radioaktiva band av rätt längd ger dig en god uppfattning om PAR-Clip experiment har fungerat och du har isolerat tillräckligt med RNA att genomföra en liten RNA-sekvensering protokoll (steg-för-steg beskrivning för cDNA-bibliotek beredning av små RNA-sekvensering finns i 19). Frekvensen av karakteristiska mutationer i sekvenserade läser, T till C övergångar när man använder 4-SU och G till A övergångar vid användning av 6-SG, vittnar om framgång tvärbundet sekvenser. Enligt vår erfarenhet uncrosslinked RNA märkta med 4-SU visar en hastighet bakgrund mutation av cirka 20%. Denna siffra har ökar till ca. 50-80% på crosslinking.

<ol>
	<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (7), 533-533 (2007).</li><li>Tenenbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays.">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 97 (26), 14085-14085 (2000).</li><li>Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+mRNAs+associated+with+the+translational+regulator+PUMILIO+in+Drosophila+melanogaster.">Genome-wide identification of mRNAs associated with the translational regulator PUMILIO in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 103 (12), 4487-4487 (2006).</li><li>Lopez de Silanes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR.">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 101 (9), 2987-2987 (2004).</li><li>Greenberg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+light-induced+crosslinking+of+mRNA+to+proteins.">Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins.</a> Nucl. Acids Res. 6 (2), 715-715 (1979).</li><li>Wagenmakers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+of+mRNA+to+proteins+by+irradiation+of+intact+cells+with+ultraviolet+light.">Cross-linking of mRNA to proteins by irradiation of intact cells with ultraviolet light.</a> Eur. J. Biochem. 112 (2), 323-323 (1980).</li><li>Mayrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+nuclear+ribonucleoprotein:+identification+of+proteins+in+contact+with+poly(A)++heterogeneous+nuclear+RNA+in+living+HeLa+cells.">Structure of nuclear ribonucleoprotein: identification of proteins in contact with poly(A)+ heterogeneous nuclear RNA in living HeLa cells.</a> The Journal of Cell Biology. 90 (2), 380-380 (1981).</li><li>Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+heterogeneous+nuclear+RNA-protein+complexes+in+vivo+with+monoclonal+antibodies.">Characterization of heterogeneous nuclear RNA-protein complexes in vivo with monoclonal antibodies.</a> Mol. Cell. Biol. 4 (6), 1104-11 (1984).</li><li>Adam, S. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+proteins+associated+with+mRNA+and+hnRNA+in+infected+HeLa+cells.">Adenovirus proteins associated with mRNA and hnRNA in infected HeLa cells.</a> J. Virol. 61 (10), 3276-3276 (1987).</li><li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain.">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1212 (2003).</li><li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-464 (2008).</li><li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells.">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (2), 130-130 (2009).</li><li>Sanford, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SFRS1+recognizes+a+functionally+diverse+landscape+of+RNA+transcripts.">Splicing factor SFRS1 recognizes a functionally diverse landscape of RNA transcripts.</a> Genome Res. 19 (3), 381-381 (2009).</li><li>Granneman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein+binding+sites+on+U3+snoRNA+and+pre-rRNA+by+UV+cross-linking+and+high-throughput+analysis+of+cDNAs.">Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. , (2009).</li><li>Guil, S., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+RNA-binding+protein+hnRNP+A1+is+required+for+processing+of+miR-18a.">The multifunctional RNA-binding protein hnRNP A1 is required for processing of miR-18a.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (7), 591-591 (2007).</li><li>Chi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps.">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-479 (2009).</li><li>Zisoulis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+discovery+of+endogenous+Argonaute+binding+sites+in+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive discovery of endogenous Argonaute binding sites in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. , (2010).</li><li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. , (2010).</li><li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microRNAs+and+other+small+regulatory+RNAs+using+cDNA+library+sequencing.">Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing.</a> Methods. 44 (1), 3-3 (2008).</li><li>Andrus, A., Kuimelis, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+composition+analysis+of+nucleosides+using+HPLC.">Base composition analysis of nucleosides using HPLC.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Chapter 10 (Unit 10.6), (2001).</li></ol>

TT är en av grundarna och vetenskaplig rådgivare till Alnylam Pharmaceuticals och en rådgivare till Regulus Therapeutics.

Buffertar och reagens Tillväxt medelstora HEK293-celler <ul><li> DMEM </li><li> 10% FBS </li><li> 2 mM L-glutamin </li><li> 100 E / ml penicillin </li><li> 100 E / ml streptomycin </li><li> 100 mikrogram / ml hygromycin </li><li> 15 mikrogram / ml blasticidin </li></ul> 4-thiouridine stamlösningen (1 m) <ul><li> 260,27 mg 4-thiouridine </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> Doxycyclin lager (10 mg / ml) <ul><li> 10 mg doxycyclin </li><li> 1 ml DMSO </li></ul> 1x NP40 lyseringsbuffert Förbered ett lager av 5x buffert utan DTT och proteashämmare. Lägg DTT och proteashämmare direkt före försöket. <ul><li> 50 mM HEPES, pH 7,5 </li><li> 150 mm KCl </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 1 mM NaF </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT </li><li> kompletta EDTA-fri proteashämmare cocktail (Roche) </li></ul> Citrat-fosfat buffert <ul><li> 4,7 g / l citronsyra </li><li> 9,2 g / l Na 2 HPO 4 </li><li> pH 5,0 </li></ul> IP-tvättbuffert <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 300 mm KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (lägg direkt innan experimentet) </li><li> kompletta EDTA-fri proteashämmare cocktail (Roche) (lägger till direkt innan experimentet) </li></ul> Hög salt tvättbuffert <ul><li> 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 </li><li> 500 mm KCl </li><li> 0,05% (v / v) NP40 </li><li> 0,5 mM DTT (lägg direkt före försöket) </li><li> kompletta EDTA-fri proteashämmare cocktail (Roche) (lägger till direkt före försöket) </li></ul> Defosforylationen buffert <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 </li><li> 100 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM DTT </li></ul> Fosfatas tvättbuffert <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 20 mM EGTA </li><li> 0,5% (v / v) NP40 </li></ul> Polynucleotide kinas (PNK) buffert utan DTT <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li></ul> PNK buffert <ul><li> 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 50 mM NaCl </li><li> 10 mM MgCl 2 </li><li> 5 mM DTT </li></ul> SDS PAGE buffert <ul><li> 10% glycerol (v / v) </li><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 </li><li> 2 mM EDTA </li><li> 2% SDS (w / v) </li><li> 100 mM DTT </li><li> 0,1% Bromfenolblått </li></ul> 2x proteinas K buffert <ul><li> 100 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 12,5 mM EDTA </li><li> 2% (w / v) SDS </li></ul>

par-clip - a method to identify transcriptome-wide the binding sites of rna binding proteins

RNA-transkript utsätts för post-transkriptionell genreglering genom att interagera med hundratals RNA-bindande proteiner (RBPs) och mikroRNA som innehåller ribonucleoprotein komplex (miRNPs) som ofta uttrycks i en cell typ dependently. För att förstå hur samspelet mellan dessa RNA-bindande faktorer påverkar regleringen av enskilda avskrifter, hög kartor upplösning av in vivo-protein-RNA-interaktion är nödvändig 1. En kombination av genetiska, biokemiska och data är vanligtvis används för att identifiera RNA-RBP eller RNA-RNP interaktioner. Microarray profilering av RNA i samband med immunopurified RBPs (RIP-Chip) 2 definierar mål på en transkriptom nivå, men dess tillämpning är begränsad till karakterisering av kinetiskt stabila interaktioner och endast i sällsynta fall 3,4 gör det möjligt att identifiera RBP erkännande elementet (RRE ) inom det långa målet RNA. Mer direkt RBP målplatsen information som erhålls genom att kombinera in vivo UV crosslinking 5,6 med immunoprecipitation 7-9 följt av isolering av tvärbunden RNA segment och cDNA sekvensering (CLIP) 10. CLIP användes för att identifiera mål för ett antal RBPs 11-17. Dock är CLIP begränsas av den låga effektiviteten i UV 254 nm RNA-protein crosslinking och placeringen av Crosslink inte är lätta att identifiera inom tvärbunden sekvenserade fragment, vilket gör det svårt att skilja UV-tvärbunden target RNA segment från bakgrunden icke tvärbunden RNA-fragment också närvarande i provet. Vi utvecklade en kraftfull cellbaserad crosslinking metod för att avgöra med hög upplösning och transkriptom hela bindningar på cellulär RBPs och miRNPs att vi termen PAR-Clip (Photoactivatable-Ribonucleoside-Förbättrad crosslinking och Immunoprecipitation) (se bild. 1A för en översikt av metoden). Metoden bygger på att införliva fotoreaktiva ribonucleoside analoger, såsom 4-thiouridine (4-SU) och 6-thioguanosine (6-SG) i vardande RNA-transkript av levande celler. Bestrålning av cellerna genom UV-ljus av 365 nm inducerar effektivt crosslinking av fotoreaktiva nukleosid-märkt cellulära RNA till samverkande RBPs. Immunoprecipitation av RBP av intresse följs av isolering av tvärbunden och coimmunoprecipitated RNA. De isolerade RNA omvandlas till ett cDNA bibliotek och djupa sekvenseras med Solexa teknik. Ett utmärkande drag för cDNA bibliotek som utarbetats av PAR-Clip är att den exakta positionen för crosslinking kan identifieras genom mutationer som bor i sekvenserat cDNA. När du använder 4-SU, tvärbundet sekvenser tymidin till cytidin övergången, medan med 6-SG resulterar i guanosin till adenosin mutationer. Förekomst av mutationer i tvärbunden sekvenser gör det möjligt att skilja dem från bakgrunden av sekvenser från rika cellulära RNA. Tillämpning av metoden på ett antal olika RNA-bindande proteiner har rapporterats i Hafner et al. 18

Watch this Scientific Journal Video about PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins at JoVE.com

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA-transkript är föremål för omfattande posttranscriptional reglering som förmedlas av en mängd gränsöverskridande agerar RNA-bindande proteiner (RBPs). Här presenterar vi en generaliserbar metod för att identifiera exakt och på ett transkriptom-omfattande RNA-bindning med RBPs.

PAR-Clip - En metod för att identifiera transkriptom hela bindningar på RNA-proteiner

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Proteomik för att identifiera proteiner Interagera med P2X2 ligandreglerade munikationsvägar

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Profilering av metyltransferaser och andra S-Adenosyl- L-Homocystein-bindande proteiner av Capture Compound masspektrometri (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Samla Variable-koncentration Isotermiska Dataset Titrering Calorimetry för att fastställa bindande mekanismer

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

iCLIP - transkriptom hela Kartläggning av protein-RNA interaktioner med individuella Nukleotid Upplösning

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Pull-down för calmodulin proteiner

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Modifierad jäst-Two-Hybrid System för att identifiera proteiner Interagera med Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosom Bundna framväxande Polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; För att identifiera Translationell Paus webbplatser Längs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

En känslig och specifik Kvantifiering Metod för fastställande av Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C av elektrokemiluminiscens Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...