Name: mouse embryonic lung culture, a system to evaluate the molecular mechanisms of branching
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching at JoVE.com

Эта работа была поддержана Сабан-исследовательский институт Предварительно докторской Award (PMDM), а также NIH RO1 HL75773 (DW).

Органная культура очень полезный и универсальный метод для изучения генов и экспрессии белка. Эти бывшие культуры методами естественных условиях можно использовать в качестве предварительного или в дополнение к в естественных исследованиях. 1. Эмбриональные изоляции легких <ol><li> Временный беременных мышей приносятся в жертву на postcoitum день 11,5 или 12,5 (E11.5-12.5) СО 2 наркоза в соответствии с НИЗ и OLAW руководящих принципов. Животное помещают в камеру и 100% СО 2 введен. После животное находится в бессознательном состоянии CO 2 потока увеличивается. Клиническая смерть животного должна быть обеспечена. </li><li> Все следующие шаги должны быть завершены в стерильных условиях в ламинарном боксе. Матка удаляется из беременных женщин. Для удаления матки из животных, беременных самок расположены на спине и опрыскивают 70% этанола. Надрез в брюшной полости и кожи удаляется, потянув кожу вверх, держа задние ноги животного. Брюшную полость открывается и матка удаляется от животного. </li><li> Кровь смывается, помещая матки в 50 мл коническую трубку, наполненную холодной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), и трубка мягко качались в течение 2 минут. </li><li> Матку помещают в чашку Петри под стереоскопическим микроскопом рассечение, и эмбрионы освобожден из матки надрезание стенки матки с помощью пружинных ножниц. Эмбрионы убирают с использованием перфорированной ложкой, и помещают на лед в новой чашки Петри содержащие HBSS. </li><li> Под стереоскопический микроскоп рассекает, эмбриональные легкие расчлененный по одному в чашки Петри, содержащие холодной HBSS (рис. 1). </li><li> Изолированных эмбриональных легких находится на льду в чашке Петри содержащие HBSS помощью стерильной пипетки передачи. </li></ol> 2. Эмбриональные культуры легких <ol><li> 500 мкл на 1 мл на лунку D-MEM/F-12 дополнена с 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина добавляют в блюда из полистирола Nunclon. </li><li> Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана помещается в верхней части средств массовой информации. Когда Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана помещается в верхней части средств массовой информации, чтобы убедиться, что блестящая сторона выступает против средств массовой информации, и грубой стороной вверх. </li><li> Расчлененный эмбриональных легких находится на вершине Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембранные использованием стерильной пипетки передачи. </li><li> Эмбриональной позиции легкого регулируется с помощью щипцов. Эмбриональные легких размещены на фильтр должен иметь нетронутой трахеи и быть размещены с их трахеи, имеющие прямое положение, что позволяет все легкие иметь те же внутреннее давление. </li><li> Блюдо Nunclon Полистирол переносится на желаемый культуры времени в клетке инкубатора (рис. 2). </li></ol> 3. Материалы 1. Эмбриональные Всего изоляции легких <ol><li> Временный беременных (C57BL6 дикого типа или трансгенных) мышей быть принесен в жертву на postcoitum день 11,5 до 13,5 (E11.5-13.5). </li><li> Сбалансированный Соль Хэнкса Решение (HBSS) (1X), жидкие, без хлорида кальция, хлорид магния или сульфата магния. (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Магазин HBSS при комнатной температуре и при температуре 4 ° С после открытия. Алиготе и хранить пенициллин-стрептомицина при температуре -20 ° C. </li><li> Стереоскопический микроскоп рассекает (Leica, Wetzlar, Германия). </li><li> Препарирование инструментов, включая Дюмон щипцы, ножницы изобразительных радужной оболочки глаза (прямо), Нойес весной ножницы и Мории ® ложке (перфорированные) (изобразительных инструментов науки, Foster City, CA). </li></ol> 2. Эмбриональные Всего культуры легких <ol><li> Дульбеко изменения Eagle среда: Питательная Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1X), жидкие, 1:1 Содержит L-глютамина, но не HEPES буфера. (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Держите бутылку DMEM/F-12 от света (например, покрыты алюминиевой фольгой) и хранить при 4 ° C. Алиготе и хранить пенициллин-стрептомицина при температуре -20 ° C. </li><li> Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана, 8.0-м, 13 мм (Ватман Nuclepore Трек-Etch мембраны (ватман, Florham Парк, штат Нью-Джерси). </li><li> Nunclon Полистирол блюда с крышками, 4 скважины (Рочестер, штат Нью-Йорк). </li><li> Одноразовые пипетки передачи, стерильные (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Препарирование E12 эмбриональных легких. (А) E12.5 весь эмбрион смотреть с правой стороны. (B) правой передней лапе был удален из эмбриона. (С) Пинцет проводимых левой рукой держа эмбриона устойчивы в блюдо. Стрелки указывают план расчленения (D) эмбриональных легких лежит кзади от сердца (удален) И впереди позвоночника. Эта цифра показывает, легких после кожи и сердца удаления. (Е) глотки удаления допускает разделение нетронутыми из легких эмбриона. (F) Посторонние глотки и пищевода ткани были отделаны прочь. Расчлененный E12.5 эмбриональных легких с неповрежденными трахеи и гортани показано на рисунке. (Cr) Черепные доли, (Med) медиальной доли, (Ca) Хвостовой доли, (ACC) Аксессуары доли, (Le) Левая доля. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. FGF9 вызывает расширение мезенхимы и расширение эпителий легких, выращенных в лабораторных условиях. (AC) E12.5 легких выращивают в течение 48 часов при отсутствии FGF9. Обратите внимание на увеличение ветвления. (DF) E12.5 легких выросла на 48 часов в присутствии FGF9. Обратите внимание на расширение эпителия и мезенхимы уже после 24 часов культуры (E). Через 48 часов (F), воздействие на эпителий становится еще более заметным. Шкала бар: AF 400 мкм 4. Полный текст протокола для этого экспериментальный подход доступен в <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">протоколах Springer</a> .

<ol>
	<li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium.">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li><li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis.">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li><li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+in+mammalian+organ+development:+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight.">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li><li>Moral, d. e. l., M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung.">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li><li>Moral, D. e. l., M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis.">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li><li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless,+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures.">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li><li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture:+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy.">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

mouse embryonic lung culture, a system to evaluate the molecular mechanisms of branching

Легкого изначальный спецификации, а также ветвление морфогенеза и формирования различных легочных клеточных поколений требует специфического взаимодействия легких энтодермы с окружающей его мезенхимы и мезотелия. Легкого мезенхимы было показано, быть источником индуктивных сигналов для легких ветвления морфогенеза. Эпителиальные-мезенхимальных-мезотелиальной взаимодействия также имеет важное значение для эмбрионального морфогенеза легких. Раннее эмбриональное органной культуры легких очень полезная система для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий. Оба эпителиальных и мезенхимальных морфогенез протекает в специфических условиях, которые можно легко манипулировать в этой системе (при отсутствии материнского влияния и кровотока). Что еще более важно этот метод может быть легко сделано в serumless определенным химическим медиа культуры. Усиление и потери функции можно достичь с помощью выразил белков, рекомбинантных вирусных векторов и / или анализа трансгенных линий мышей, антисмысловые РНК, а также РНК-интерференции генов нокдаун.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching at JoVE.com

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Раннее эмбриональное органной культуры легких очень полезная система для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий. Оба эпителиальных и мезенхимальных морфогенез протекает в специфических условиях, которые можно легко манипулировать в этой системе.

Мышиных эмбриональных легких культуры, системы оценки Молекулярные механизмы Ветвление

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Выделение и культуре клеток из нефрогенной зона эмбриональных почек мышь

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Визуализация Caenorhabditis Elegans Кутикулы структур с помощью липофильных Vital краска, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Система<em&gt; Бывших естественных условиях</em&gt; Культивирования эмбриональных поджелудочной железы

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Роман<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Метод эмбриональном сердце мыши

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Мышь эмбрионального развития целая культура системе эмбрионов бессывороточных

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Процедура оценки эффективности флокулянтов для удаления дисперсных частиц из растительных экстрактов

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...