Name: mouse embryonic lung culture, a system to evaluate the molecular mechanisms of branching
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Saban Research Institute doktorander Award (PMDM), och genom NIH RO1 HL75773 (DW).

Organ kultur är en mycket användbar och mångsidig teknik för att studera gen-och proteinuttryck. Dessa ex vivo kultur metoder kan användas som preliminära eller komplement till in vivo-studier. 1. Embryonala Lung Isolering <ol><li> Begränsad-gravida möss offras på postcoitum dag 11,5 eller 12,5 (E11.5-12,5) av CO 2 narkos enligt NIH och OLAW riktlinjer. Djuret placeras i en kammare och 100% CO 2 införs. Efter att djuret är medvetslöst CO 2-flödet ökar. Kliniska avliva djuret måste säkerställas. </li><li> Alla följande steg måste slutföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde huva. Livmodern tas bort från gravida kvinnor. För att ta bort livmodern på djuret, är dräktiga honor placeras på deras rygg och besprutas med 70% etanol. Ett snitt görs i buken, och huden tas bort genom att dra huden uppåt medan du håller i djurets bakben. Bukhålan öppnas och livmodern tas bort från djuret. </li><li> Blodet sköljs bort genom att placera i livmodern i en 50 ml koniska rör fyllt med kallt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), och röret försiktigt gungade i 2 minuter. </li><li> Livmodern är sedan placeras i en petriskål under stereoskopiska dissekera mikroskop, och embryona frigörs från livmodern genom öppning av livmoderväggen med Spring sax. Embryona skördas med en perforerad sked, och placeras på is i en ny petriskål innehåller HBSS. </li><li> Enligt den stereoskopiska dissekera mikroskop, är embryonala lungor dissekeras en efter en i en petriskål med kallt HBSS (Figur 1). </li><li> De isolerade embryonala lungan läggs på is i en petriskål med HBSS med en steril överföringspipett. </li></ol> 2. Embryonala Lung Kultur <ol><li> 500 mikroliter till 1 milliliter per brunn av D-MEM/F-12 kompletteras med 50 enheter / ml penicillin, streptomycin läggs i en Nunclon Polystyren maträtt. </li><li> En Nuclepore Polykarbonat Track-Etch membran är placerad på toppen av media. När Nuclepore Polykarbonat Track-Etch membran är placerad på toppen av media, se till att den blanka sidan är mot media, och grova sidan är vänd uppåt. </li><li> En dissekerade embryonala lunga är placerad på toppen av Nuclepore Polykarbonat Track-Etch Membran med en steril överföringspipett. </li><li> Den embryonala lungan läge justeras med hjälp av pincetten. Embryonala lunga placeras på filtret ska ha en intakt luftstrupe och placeras med sin luftstrupen ha en rak position, så att alla lungorna har samma inre tryck. </li><li> Den Nunclon Polystyren maträtt överförs till den önskade kulturen tiden i en cell inkubator (figur 2). </li></ol> 3. Material 1. Embryonala Hela Lung Isolering <ol><li> Begränsad-gravida (C57BL6 vildtyp eller transgena) möss som ska offras på postcoitum dag från 11,5 till 13,5 (E11.5-13,5). </li><li> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), flytande, utan kalciumklorid, magnesiumklorid, eller magnesiumsulfat. (Invitrogen, Carlsbad, CA) kompletterat med 50 enheter / ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Förvara HBSS vid rumstemperatur och vid 4 ° C efter öppnandet. Alikvotera och lagra Penicillin-streptomycin vid -20 ° C. </li><li> Stereoskopiska dissekera mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland). </li><li> Dissection verktyg inklusive Dumont pincett, Fine iris sax (raka), Noyes våren sax och Moria ® sked (perforerade) (Fine Science Tools, Foster City, CA). </li></ol> 2. Embryonala Hela Lung Kultur <ol><li> Dulbecco ändrade Eagle Medium: Nutrient Blanda F-12 (D-MEM/F-12) (1X), flytande, Innehåller 01:01 L-glutamin, men ingen HEPES buffert. (Invitrogen, Carlsbad, CA) kompletterat med 50 enheter / ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Håll DMEM/F-12 flaskan bort från ljus (t.ex. omfattas av aluminiumfolie) och förvara vid 4 ° C. Alikvotera och lagra Penicillin-streptomycin vid -20 ° C. </li><li> Nuclepore Polykarbonat Track-Etch Membran, 8,0 m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membran (Whatman, Florham Park, NJ). </li><li> Nunclon Polystyren skålen med lock, 4 brunnar (Rochester, NY). </li><li> Disponibel överföringspipetter, sterila (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Dissekering av E12 embryonala lungorna. (A) E12.5 hela embryo sett från höger sida. (B) Rätt forelimb har tagits bort från embryot. (C) Tång som innehas av den vänstra handen håller embryot stadigt i skålen. Pilarna anger plan dissektion (D) Embryonala lung ligger posteriort om hjärtat (bort) Och främre till ryggraden. Bilden visar lungorna efter hud och hjärta borttagning. (E) Svalget borttagning gör separation av intakta lungan från embryot. (F) Främmande farynx vävnad och matstrupe har trimmas bort. Dissekerade E12.5 embryonala lunga med intakt luftstrupen och struphuvudet visas. (Cr) Kranial lob, (Med) Medial lob, (Ca) caudal lob, (ACC) Tillbehör lob, (Le) vänster lob. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. FGF9 inducerar expansion av mesenkym och utvidgning av epitel i lunga vuxit in vitro. (AC) E12.5 lungan odlas för 48 timmar i frånvaro av FGF9. Notera ökningen av förgrening. (DF) E12.5 lunga som odlas för 48 timmar i närvaro av FGF9. Notera utvidgning av epitel och mesenkym så tidigt som efter 24 timmars kultur (E). Efter 48 timmar (F), är effekten på epitelet ännu mer uttalad. Skala bar: AF 400 ìm 4. Den fullständiga texten protokollet för denna experimentella strategi finns i <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">Springer protokoll</a> .

<ol>
	<li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium.">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li><li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis.">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li><li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+in+mammalian+organ+development:+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight.">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li><li>Moral, d. e. l., M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung.">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li><li>Moral, D. e. l., M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis.">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li><li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless,+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures.">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li><li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture:+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy.">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li></ol>

mouse embryonic lung culture, a system to evaluate the molecular mechanisms of branching

Lung ursprungliga specifikationen samt förgrening morfogenes, och bildandet av olika pulmonell cell linjer kräver en viss interaktion i lungan endoderm med omgivande mesenkym och mesothelium. Lung mesenkym har visat sig vara källan till induktiva signaler för lung förgrening morfogenes. Epitelial-mesenkymala-mesothelial interaktioner är också kritiska till embryonala lunga morfogenes. Tidig embryonal lunga orgel kulturen är ett mycket användbart system för att studera epiteliala-mesenkymala interaktioner. Både epiteliala och mesenkymala morfogenes intäkter under särskilda förhållanden som lätt kan manipuleras på detta system (i avsaknad av moderns inflytande och blodflöde). Ännu viktigare är denna teknik kan lätt göras i en serumless, kemiskt definierade kultur media. Vinst och förlust av funktion kan uppnås genom uttryckta proteinerna, rekombinanta, virala vektorer och / eller analys av transgena musstammar, antisense-RNA, samt RNA-interferens gen knockdown.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching at JoVE.com

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Tidig embryonal lunga orgel kulturen är ett mycket användbart system för att studera epiteliala-mesenkymala interaktioner. Både epiteliala och mesenkymala morfogenes intäkter under särskilda förhållanden som lätt kan manipuleras i detta system.

Mus embryonala Lung kultur, ett system för att utvärdera de molekylära mekanismerna för Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualisering av Caenorhabditis elegans Cuticle strukturer med hjälp av den lipofila Vital Dye, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Ett system för<em&gt; Ex vivo</em&gt; Odling av embryonala Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Explantat att testa Cell Fate engagemang under embryonal utveckling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mouse embryonala utveckling i ett serumfritt Hela Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Förfarande för att utvärdera effektiviteten av flockningsmedel för att avlägsna dispergerade partiklarna från växtextrakt

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...