Name: primer-free aptamer selection using a random dna library
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00
Duration: 11 min 14 s
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Nous remercions Paul Craig à l&#39;installation de base biopuces pour son aide. Ce travail a été soutenu par le NIH / NCI octroi # CA118591 du Programme IMAT. SLD reconnaît également un espace de Pennsylvanie Grant Consortium bourse de soutien financier. Cette publication a été également soutenu par la Pennsylvania State University Matériaux Institut de recherche Nano réseau de fabrication et la National Science Foundation Accord de coopération n ° 0335765, réseau national d&#39;infrastructure nanotechnologie, avec l&#39;Université Cornell.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HotMaster TAQ DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-32P-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:ChCl3:IAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Restriction Enzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photographic Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ECE Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene Column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaAc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Detroit-551 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SK-MEL-31 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sp6 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SensiScript Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR-2.1-TOPO Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DH5&alpha; Compotent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector NTI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&gamma;-32P-ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primer-free aptamer selection using a random dna library

Les aptamères sont des oligonucléotides hautement structurés (ADN ou ARN) qui peuvent se lier à des cibles avec des affinités comparables aux anticorps 1. Ils sont identifiés par un processus de sélection in vitro appelée évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) pour reconnaître une grande variété de cibles, à partir de petites molécules à des protéines et autres macromolécules 2-4. Les aptamères ont des propriétés qui sont bien adaptés pour in vivo de diagnostic et / ou des applications thérapeutiques: Outre une bonne spécificité et d&#39;affinité, ils sont facilement synthétisés, survivre à des conditions de traitement plus rigoureux, ils sont peu immunogènes, et leur taille relativement petite peut entraîner la pénétration facile des tissus. Les aptamères qui sont identifiés par le processus SELEX standards comprennent généralement ~ 80 nucléotides (nt), car ils sont généralement choisis dans les bibliothèques d&#39;acides nucléiques avec ~ 40 nt à long régions randomisée en plus des sites d&#39;amorce fixe de ~ 20 nt de chaque côté. Les séquences des amorces fixes ne peuvent donc représentent près de ~ 50% des séquences de bibliothèque, et peuvent donc positivement ou négativement compromis identification des aptamères dans le processus de sélection des trois, bien que les approches de bioinformatique suggèrent que les séquences fixes ne contribuent pas de manière significative à la structure après la sélection aptamère 5 . Pour répondre à ces problèmes potentiels, des séquences d&#39;amorces ont été bloqués par des oligonucléotides complémentaires ou commuté à Midway différentes séquences au cours des tours de SELEX 6, ou ils ont été taillés à 6-9 NT 7, 8. Wen et Gray 9 conçu un apprêt sans méthode SELEX génomique, dans laquelle les séquences des amorces ont été complètement retirés de la bibliothèque avant la sélection et ont été ensuite régénéré pour permettre l&#39;amplification de l&#39;fragments génomiques sélectionnés. Cependant, d&#39;employer la technique, d&#39;une bibliothèque génomique unique doit être construit, qui possède la diversité limitée, et la régénération après cycles de sélection repose sur une étape réamplification linéaire. Sinon, les efforts visant à contourner les problèmes causés par des séquences d&#39;amorces fixes en utilisant le partitionnement à haute efficacité sont remplies avec des problèmes concernant l&#39;amplification par PCR 10. Nous avons développé une méthode d&#39;amorce sans sélection (PF) qui simplifie considérablement les procédures de SELEX et élimine efficacement les interférences problèmes amorce 11, 12. Les protocoles de travail d&#39;une manière directe. La région centrale aléatoire de la bibliothèque est purifiée sans parasites séquences flanquantes et est lié à une cible appropriée (par exemple pour une protéine purifiée ou de mélanges complexes tels que les lignées cellulaires). Puis les séquences liées sont obtenues, réunis avec des séquences flanquantes, et re-amplifiés pour générer certains sous-bibliothèques. À titre d&#39;exemple, voici, nous avons sélectionné des aptamères d&#39;S100B, un marqueur protéique de mélanome. Essais de liaison ont montré Kd s dans les 10 -7 à 10 -8 M large après quelques tours de sélection, et nous démontrons que les aptamères fonctionner efficacement dans un format en sandwich contraignant.

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Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

SELEX protocoles comprennent plusieurs tours de sélection, dont chacun nécessite la régénération des ligands, qui exigent à leur tour des séquences d&#39;amorces flanquant les régions fixes bibliothèque aléatoire. Ces séquences d&#39;amorces fixes peuvent interférer avec le processus de sélection (faux positifs et négatifs). Nous présentons ici un apprêt sans protocole.

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