Name: primer-free aptamer selection using a random dna library
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00
Duration: 11 min 14 s
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Ringraziamo Paul Craig presso l&#39;impianto di core Microarray per il suo aiuto. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NCI concedere # CA118591 dal Programma IMAT. SLD riconosce anche un Pennsylvania Spazio Concessione borse di studio del Consorzio per il sostegno finanziario. Questa pubblicazione è stata sostenuta anche dalla Pennsylvania State University Materials Research Institute Nano Fabrication Rete e la National Science Foundation accordo Cooperative n ° 0335765, National Nanotechnology Network Infrastructure, con la Cornell University.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HotMaster TAQ DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-32P-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:ChCl3:IAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Restriction Enzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photographic Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ECE Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene Column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaAc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Detroit-551 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SK-MEL-31 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sp6 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SensiScript Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR-2.1-TOPO Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DH5&alpha; Compotent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector NTI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&gamma;-32P-ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primer-free aptamer selection using a random dna library

Aptameri oligonucleotidi sono altamente strutturate (DNA o RNA) che possono legarsi a bersagli con affinità paragonabile agli anticorpi 1. Essi sono identificati attraverso un processo di selezione in vitro chiamato Evolution sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX) di riconoscere un&#39;ampia varietà di obiettivi, da piccole molecole di proteine ​​e altre macromolecole 2-4. Aptameri hanno proprietà che sono adatti per diagnostica in vivo e / o applicazioni terapeutiche: Oltre a una buona specificità e affinità, sono facilmente sintetizzata, sopravvivere a condizioni più rigorose di lavorazione, essi sono scarsamente immunogenici, e le loro dimensioni relativamente piccole possono causare la penetrazione di facile tessuti. Aptameri che sono identificati attraverso il processo di SELEX serie comprende normalmente ~ 80 nucleotidi (nt), dal momento che sono in genere scelti dalle librerie acidi nucleici con ~ 40 nt regioni lungo randomizzato più siti fondo fisso di circa 20 nt su ogni lato. Le sequenze di innesco fisso quindi possono comprendere circa il circa il 50% delle sequenze biblioteca, e quindi possono positivamente o negativamente compromesso identificazione aptameri nel processo di selezione 3, anche se si avvicina bioinformatica suggeriscono che le sequenze fisso non contribuiscono significativamente alla aptamero struttura dopo la selezione 5 . Per affrontare questi problemi potenziali, sequenze primer sono stati bloccati da oligonucleotidi complementari o passati a diverse sequenze a metà strada durante il giro di SELEX 6, o sono stati tagliati a 6-9 nt 7, 8. Wen e grigio 9 progettato un primer senza metodo SELEX genomica, in cui le sequenze di innesco sono stati completamente rimossi dalla libreria prima selezione e sono stati poi rigenerato per consentire l&#39;amplificazione dei frammenti genomici selezionato. Tuttavia, di impiegare la tecnica, una libreria genomica unico deve essere costruita, che possiede la diversità limitato, e la rigenerazione dopo round di selezione si basa su un passo reamplification lineare. In alternativa, i tentativi di aggirare i problemi causati da sequenze primer fissi usando il partizionamento ad alta efficienza sono incontrato con problemi per quanto riguarda l&#39;amplificazione PCR 10. Abbiamo sviluppato un primer-free (PF) metodo di selezione che semplifica notevolmente le procedure di SELEX ed elimina in modo efficace problemi di fondo-interferenza 11, 12. I protocolli di lavoro in modo semplice. La regione centrale casuale della biblioteca è purificata senza estranei sequenze fiancheggianti ed è destinato a un target adeguato (ad esempio per una proteina purificata o miscele complesse come linee cellulari). Poi le sequenze legate sono ottenuti, riunito con sequenze di accompagnamento, e ri-amplificato per generare secondarie selezionate librerie. Come esempio, qui abbiamo selezionato aptameri a S100B, un marker di proteine ​​per il melanoma. Analisi di legame ha mostrato Kd s nel 10 -7 - 10 -8 gamma M dopo un paio di giri di selezione, e dimostriamo che la aptameri funzionare in modo efficace in un formato panino vincolante.

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Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Protocolli di SELEX comprendono vari cicli di selezione, ognuno dei quali richiedono la rigenerazione di leganti legato, che a loro volta richiedono sequenze primer fisso fiancheggianti le regioni biblioteca casuale. Queste sequenze di innesco fisso può interferire con il processo di selezione (falsi positivi e negativi). Qui vi presentiamo un primer senza protocollo.

Primer-Free Selezione aptamero utilizzando una libreria di DNA casuale

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

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