Name: primer-free aptamer selection using a random dna library
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00
Duration: 11 min 14 s
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我々は彼の助けのためのマイクロアレイの中核施設で、クレイグポールに感謝する。この作業は、IMATプログラムからNIH / NCIの助成金＃CA118591によってサポートされていました。 SLDは、金融支援のためのペンシルベニアスペースグラントコンソーシアムのフェローシップを認めている。この出版物はまた、ペンシルベニア州立大学の材料研究所ナノファブリケーションネットワークと国立科学財団協力協定第0335765、コーネル大学と国家ナノテクノロジー基盤ネットワーク、によってサポートされていました。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HotMaster TAQ DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-32P-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:ChCl3:IAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Restriction Enzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photographic Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ECE Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene Column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaAc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Detroit-551 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SK-MEL-31 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sp6 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SensiScript Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR-2.1-TOPO Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DH5&alpha; Compotent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector NTI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&gamma;-32P-ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primer-free aptamer selection using a random dna library

アプタマーは、抗体1〜匹敵する親和性を持つターゲットにバインドすることができる高度に構造化されたオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNA）です。彼らは、小分子から蛋白質と他の高分子2-4に、ターゲットの多種多様を認識するために指数濃縮（SELEX） ​​によってリガンドの系統進化と呼ばれる試験管内選択プロセスにおけるを通して識別されます。アプタマーは、よくインビボ診断および/または治療用途のために適しているプロパティがあります：優れた特異性と親和性に加えて、それらが容易に合成され、より厳密な処理条件を生き残る、それらは不完全に免疫原性であり、そしてそれらの比較的小さいサイズではの容易な侵入が発生する可能性が組織。 彼らは通常、それぞれの側に〜40 ntの長い無作為地域プラス〜20ヌクレオチドの固定プライマー部位を有する核酸のライブラリーから選択されるので、標準のSELEXプロセスを通じて識別されるアプタマーは、通常、約80ヌクレオチド（nt）を含む。バイオインフォマティクスのアプローチは、固定の配列が選択5の後にアプタマーの構造に大きく貢献していないことを示唆しているが、固定されたプライマー配列は、このように〜ほぼライブラリー配列の50％を含むことができるため、肯定的または否定的選択プロセス3のアプタマーの同定を危険にさらす可能性があります。 。これらの潜在的な問題に対処するために、プライマーの配列は、相補的なオリゴヌクレオチドによってブロックまたはSELEX 6のラウンド中に、異なるシーケンスの途中に切り替え、またはそれらは6月9日NT 7、8にトリミングされているされています。温とグレー9は 、プライマー、フリーのゲノムSELEX法を設計したプライマーの配列は完全に選択する前に、ライブラリから削除され、その後、選択されたゲノム断片の増幅を可能にするために再生した。しかし、テクニックを採用する、ユニークなゲノムライブラリーは、限られた多様性を有している、構築する必要があり、選択のラウンド後の再生は、リニア再増幅のステップに依存しています。また、高効率のパーティショニングを使用して固定されたプライマー配列によって引き起こされる問題を回避する努力は、PCR増幅10に関する問題で満たされている。 我々は大幅にSELEX手続きを簡素化し、効果的プライマー干渉問題11,12を排除プライマーフリー（PF）の選択方法を開発した。プロトコルは、簡単な方法で動作します。ライブラリの中心的なランダムな領域は、余分なフランキング配列なしで精製され、適切なターゲット（精製されたタンパク質またはそのような細胞株などの複雑な混合物に、例えば）にバインドされています。その後、バインドされたシーケンスは、得られた隣接配列と再会し、選択したサブライブラリーを生成するために再増幅されています。例として、ここでは、S100B、黒色腫のためのタンパク質マーカーにアプタマーを選択する。選択の数ラウンド後に10 -8 Mの範囲を、そして我々はアプタマーは、サンドイッチバインディング形式で効果的に機能することを示している-結合アッセイは、10 -7でのKdのを示した。

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Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

SELEXのプロトコールは、順番にランダムライブラリ領域に隣接する固定プライマー配列を必要とする結合リガンドの再生を必要とするそれぞれの選択の複数のラウンドを、含み。これらの固定プライマー配列は、選択プロセス（偽陽性と陰性）の妨げになることがあります。ここでは、プライマーのないプロトコルを提示する。

ランダムDNAライブラリーを使用するプライマーフリーアプタマーの選択

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

プロービングDNA安定同位体（DNA - SIP）

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

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ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

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組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

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レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

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