Name: primer-free aptamer selection using a random dna library
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00
Duration: 11 min 14 s
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우리는 그의 도움을 Microarray 핵심 시설에 크레이그 폴 감사합니다. 이 작품은 IMAT 프로그램에서 NIH / NCI 부여 # CA118591에 의해 지원되었다. SLD는 재정 지원을위한 펜실베니아 공간 부여 컨소시엄 활동을 인정한다. 이 책자는 또한 펜실베니아 주립 대학 재료 연구소 나노 제작 네트워크와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 공동 계약 코넬 대학과 번호 0335765, 국가 나노기술 인프라 네트워크에 의해 지원되었다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HotMaster TAQ DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-32P-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:ChCl3:IAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Restriction Enzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photographic Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ECE Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene Column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaAc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Detroit-551 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SK-MEL-31 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sp6 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SensiScript Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR-2.1-TOPO Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DH5&alpha; Compotent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector NTI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&gamma;-32P-ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primer-free aptamer selection using a random dna library

Aptamers는 항체 1 비교 동질성과 목표에 바인딩할 수 고도로 구조화된 oligonucleotides (DNA 또는 RNA)입니다. 그들은 작은 분자에서 단백질 및 기타 macromolecules 2-4로 대상의 다양한 인식 지수 농축 (SELEX)의 리간드의 체계적인 진화라는 체외 선정 과정에서를 통해 식별됩니다. Aptamers 잘 생체내 진단 및 / 또는 치료 응용 프로그램에 적합 한 특성을 가지고 있습니다 : 좋은 특이성과 친화력 게다가, 쉽게 합성되며, 더 엄격한 가공 조건을 살아남기, 그들은 제대로 immunogenic하고, 그들의 비교적 작은 크기의 손쉬운 보급률이 발생할 수 있습니다 티슈. 그들은 일반적으로 양쪽에 ~ 40 NT 긴 무작위 지역 플러스 ~ 20 NT의 고정 뇌관 사이트와 핵산 라이브러리에서 선택한 있기 때문에 표준 SELEX 과정을 통해 확인할 수 있습니다 Aptamers는 일반적으로, ~ 80 세포핵 (NT)를 구성. 생물 정보학의 접근 방식은 고정 시퀀스 선택 5시 이후엔 aptamer 구조에 크게 기여하지 않는 것이 좋습니다하지만 고정 뇌관 시퀀스는, 따라서 ~ 거의 라이브러리 시퀀스의 50 %를 구성 수 있으며, 따라서 긍정적 으로든 부정적 으로든 선정 과정 3 aptamers의 신분을 손상시킬 수 . 이러한 잠재적인 문제를 해결하기 위해, 뇌관 시퀀스는 상호 보완 oligonucleotides에 의해 차단된 또는 SELEX 6 라운드 동안 다른 시퀀스의 미드웨이로 전환하거나, 그들은 6-9 NT 7, 8 손질했습니다되었습니다. 웬 앤드 그레이 9, 입문서없는 게놈 SELEX 방법을 설계하는 뇌관 시퀀스 완전히 선택하기 전에 라이브러리에서 제거되었습니다 다음 선택한 게놈 조각의 증폭을 허용하는 생성되었습니다. 그러나 기술을 채용하기 위해 고유의 게놈 라이브러리 구축되어야, 어떤이 제한 다양성을 보유하고, 선택의 라운드 후 재생은 선형 reamplification 단계에 의존합니다. 또한, 고효율 파티션을 사용하여 고정 뇌관 시퀀스로 인한 문제를 회피하기위한 노력은 PCR 증폭 10에 관한 문제 충족하고 있습니다. 우리는 크게 SELEX 절차를 단순화하고 효율적으로 프라이머 - 간섭 문제 11, 12를 제거하는 입문서 무료 (PF) 선택 방법을 개발했습니다. 프로토콜은 간단한 방식으로 작동합니다. 라이브러리의 중앙 무작위 지역 관​​계없는 측면 순서없이 정화하고 적당한 대상 (정화 단백질이나 세포 라인과 같은 복잡한 혼합물로 예를 들면)에 바인딩됩니다. 그러면 바운드 시퀀스가​​ 얻은 측면 시퀀스와 상봉하고, 선택된 하위 라이브러리를 생성하기 위해 다시 증폭됩니다. 예를 들어, 우리가 S100B, 흑색증의 단백질 마커에 aptamers을 선택했습니다. 선택의 몇 라운드 후 10 -8 M 범위를, 그리고 우리는 aptamers가 샌드위치 바인딩 형식에서 효과적으로 기능 것을 입증 - 바인딩 assays는 10 -7에서 KD S을 보여주었다.

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Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

SELEX의 프로토콜 설정에서 임의의 라이브러리 영역을 측면 고정 프라이머 시퀀스를 요구 바운드 리간드의 재생을 필요로 각각의 선택 여러 라운드를 구성. 이러한 고정 프라이머 시퀀스는 선택 프로세스 (잘못된 반응과 제외)을 방해할 수 있습니다. 여기 입문서없는 프로토콜을 제시한다.

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