Name: primer-free aptamer selection using a random dna library
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00
Duration: 11 min 14 s
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Agradecemos a Paul Craig no Centro de Núcleo Microarray por sua ajuda. Este trabalho foi financiado pelo NIH CA118591 # / NCI bolsa do Programa IMAT. SLD também reconhece um Pennsylvania Espaço Grant Fellowship Consórcio de apoio financeiro. Esta publicação foi também apoiada pela Pennsylvania State University Materials Research Institute Nano Fabricação de rede e da National Science Foundation Acordo de Cooperação n º 0335765, Rede Nacional de Infra-estrutura de Nanotecnologia, com Cornell University.

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	<li>Kulbachinskiy, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+selection+of+aptamers+to+protein+targets.">Methods for selection of aptamers to protein targets.</a> Biochemistry (Moscow). 72, 1505-1518 (2006).</li><li>Mairal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+molecular+tools+for+analytical+applications.">Aptamers: molecular tools for analytical applications.</a> Anal Bioanal Chem. 390, 989-1007 (2008).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX+--+A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX -- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolec Engineering. 24, 381-403 (2007).</li><li>Que-Gewirth, N. S., Sullenger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+RNA+aptamers.">Gene therapy progress and prospects: RNA aptamers.</a> Gene Ther. 14, 283-2891 (2007).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> J Mol Evol. 67, 95-102 (2008).</li><li>Shtatland, T., Gill, S. C., Javornik, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Escherichia+coli+RNA+with+bacteriophage+MS2+coat+protein:+genomic+SELEX.">Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 28, E93-E93 (2000).</li><li>Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+using+a+dual+RNA+library+that+allows+primerless+selection.">In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection.</a> Nucleic Acids Res. 34, E86-E86 (2006).</li><li>Vater, A., Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+bioactive+Spiegelmers+to+migraine-associated+calcitonin+gene-related+peptide+rapidly+identified+by+a+novel+approach:+tailored-SELEX.">Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 31, E130-E130 (2003).</li><li>Wen, J. D., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+genomic+sequences+that+bind+tightly+to+Ff+gene+5+protein:+primer-free+genomic+SELEX.">Selection of genomic sequences that bind tightly to Ff gene 5 protein: primer-free genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 32, E182-E182 (2004).</li><li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue.">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal Chim Acta. 564, 91-916 (2006).</li><li>Pan, W. H., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-free+aptamer+selection+using+a+random+DNA+library.">Primer-free aptamer selection using a random DNA library.</a> Methods Mol Biol. , (2009).</li><li>Pan, W., Xin, P., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal-Primer+and+Primer-Free+SELEX+Protocols+for+Selection+of+Aptamers+from+Random+DNA+Libraries.">Minimal-Primer and Primer-Free SELEX Protocols for Selection of Aptamers from Random DNA Libraries.</a> BioTechniques. 44, 351-360 (2008).</li><li>Nicewarner-Pena, S., Freeman, G., Reiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicrometer+metallic+barcodes.">Submicrometer metallic barcodes.</a> Science. 294, 137-141 (2001).</li><li>JC, H. u. l. t. e. e. n., CR, M. a. r. t. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+template-based+method+for+the+preparation+of+nanomaterials.">A general template-based method for the preparation of nanomaterials.</a> J Materials Chem. 7, 1075-1087 (1997).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HotMaster TAQ DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-32P-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:ChCl3:IAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Restriction Enzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photographic Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ECE Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene Column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaAc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Detroit-551 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SK-MEL-31 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sp6 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SensiScript Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR-2.1-TOPO Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DH5&alpha; Compotent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector NTI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&gamma;-32P-ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primer-free aptamer selection using a random dna library

Aptâmeros são oligonucleotides altamente estruturado (DNA ou RNA) que pode vincular a metas, com afinidades comparáveis ​​aos anticorpos 1. Eles são identificados através de um processo de seleção in vitro chamada Evolução Sistemática de Ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) para reconhecer uma grande variedade de alvos, a partir de pequenas moléculas para proteínas e outras macromoléculas 2-4. Aptâmeros têm propriedades que são adequados para diagnóstico in vivo e / ou aplicações terapêuticas: Além de boa especificidade e afinidade, eles são facilmente sintetizado, sobreviver a condições de processamento mais rigoroso, eles estão pouco imunogênico, e seu tamanho relativamente pequeno pode resultar na penetração de fácil tecidos. Aptâmeros que são identificados através do processo SELEX padrão geralmente compreendem ~ 80 nucleotídeos (nt), uma vez que normalmente são selecionados a partir de bibliotecas de ácido nucléico com ~ 40 nt longo randomizado regiões mais sites de cartilha fixa de ~ 20 nt em cada lado. As seqüências de primers fixo, assim, pode compreender cerca de ~ 50% das seqüências de biblioteca, e, portanto, pode positiva ou negativamente compromisso identificação de aptâmeros no processo de seleção 3, embora abordagens bioinformática sugerem que as seqüências fixas não contribuem significativamente para aptamer estrutura após cinco seleção . Para resolver esses problemas em potencial, seqüências de primers foram bloqueadas por oligonucleotídeos complementares ou mudado para diferentes seqüências no meio do caminho durante as rodadas de SELEX 6, ou elas foram aparadas para 6-9 nt 7, 8. Wen e Gray 9 desenhado um primer sem método SELEX genômica, em que as seqüências de primers foram completamente removido da biblioteca antes da seleção e, em seguida, foram regenerados para permitir a amplificação dos fragmentos do genoma selecionado. No entanto, a empregar a técnica, uma biblioteca genômica único tem que ser construída, que possui diversidade limitada, e regeneração após rodadas de seleção depende de um passo reamplificação linear. Alternativamente, os esforços para contornar problemas causados ​​por seqüências de primers fixa usando o particionamento de alta eficiência são atendidas com problemas em relação a amplificação 10. Nós desenvolvemos uma cartilha livre método de seleção (PF) que simplifica significativamente os procedimentos SELEX e elimina eficazmente cartilha interferência de problemas 11, 12. Os protocolos de trabalhar de uma forma simples. A região central aleatórios da biblioteca é purificada sem seqüências estranhas de acompanhamento e está vinculado a um destino adequado (por exemplo, para uma proteína purificada ou misturas complexas, tais como linhas de células). Em seguida, as seqüências são obtidos ligado, se reuniu com seqüências de acompanhamento e re-amplificado para gerar selecionado sub-bibliotecas. Como exemplo, aqui nós selecionamos aptâmeros a S100B, uma proteína marcadora de melanoma. Ensaios de ligação mostrou Kd s na 10 -7 - 10 -8 M gama após algumas rodadas de seleção, e demonstramos que a aptâmeros funcionar efetivamente em um formato sanduíche vinculativo.

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Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Protocolos SELEX compreendem várias rodadas de seleção, cada um dos que exigem a regeneração de ligantes vinculado, que por sua vez requerem seqüências de primers que flanqueiam as regiões fixo biblioteca aleatória. Essas seqüências de primers fixo pode interferir com o processo de seleção (falsos positivos e negativos). Aqui apresentamos um primer sem protocolo.

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

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