Name: primer-free aptamer selection using a random dna library
Uploaded: 2010-07-26T17:00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library at JoVE.com

Damos las gracias a Craig Pablo en el Fondo para el núcleo de microarrays por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por el NIH / NCI subvención # CA118591 del Programa de IMAT. SLD también reconoce un Pennsylvania Space Grant Consortium for beca de apoyo financiero. Esta publicación fue apoyada también por la Universidad Estatal de Pennsylvania Materiales del Instituto de Investigación Nano Fabricación de redes y la Fundación Nacional de Ciencias Acuerdo de Cooperación No. 0335765, la National Nanotechnology Infraestructura de red, con la Universidad de Cornell.

<ol>
	<li>Kulbachinskiy, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+selection+of+aptamers+to+protein+targets.">Methods for selection of aptamers to protein targets.</a> Biochemistry (Moscow). 72, 1505-1518 (2006).</li><li>Mairal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamers:+molecular+tools+for+analytical+applications.">Aptamers: molecular tools for analytical applications.</a> Anal Bioanal Chem. 390, 989-1007 (2008).</li><li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SELEX+--+A+(r)evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands.">SELEX -- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolec Engineering. 24, 381-403 (2007).</li><li>Que-Gewirth, N. S., Sullenger, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+progress+and+prospects:+RNA+aptamers.">Gene therapy progress and prospects: RNA aptamers.</a> Gene Ther. 14, 283-2891 (2007).</li><li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures.">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> J Mol Evol. 67, 95-102 (2008).</li><li>Shtatland, T., Gill, S. C., Javornik, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Escherichia+coli+RNA+with+bacteriophage+MS2+coat+protein:+genomic+SELEX.">Interactions of Escherichia coli RNA with bacteriophage MS2 coat protein: genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 28, E93-E93 (2000).</li><li>Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+using+a+dual+RNA+library+that+allows+primerless+selection.">In vitro selection using a dual RNA library that allows primerless selection.</a> Nucleic Acids Res. 34, E86-E86 (2006).</li><li>Vater, A., Jarosch, F., Buchner, K., Klussmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+bioactive+Spiegelmers+to+migraine-associated+calcitonin+gene-related+peptide+rapidly+identified+by+a+novel+approach:+tailored-SELEX.">Short bioactive Spiegelmers to migraine-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 31, E130-E130 (2003).</li><li>Wen, J. D., Gray, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+genomic+sequences+that+bind+tightly+to+Ff+gene+5+protein:+primer-free+genomic+SELEX.">Selection of genomic sequences that bind tightly to Ff gene 5 protein: primer-free genomic SELEX.</a> Nucleic Acids Res. 32, E182-E182 (2004).</li><li>Musheev, M. U., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+aptamers+by+systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment:+addressing+the+polymerase+chain+reaction+issue.">Selection of aptamers by systematic evolution of ligands by exponential enrichment: addressing the polymerase chain reaction issue.</a> Anal Chim Acta. 564, 91-916 (2006).</li><li>Pan, W. H., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-free+aptamer+selection+using+a+random+DNA+library.">Primer-free aptamer selection using a random DNA library.</a> Methods Mol Biol. , (2009).</li><li>Pan, W., Xin, P., Clawson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal-Primer+and+Primer-Free+SELEX+Protocols+for+Selection+of+Aptamers+from+Random+DNA+Libraries.">Minimal-Primer and Primer-Free SELEX Protocols for Selection of Aptamers from Random DNA Libraries.</a> BioTechniques. 44, 351-360 (2008).</li><li>Nicewarner-Pena, S., Freeman, G., Reiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicrometer+metallic+barcodes.">Submicrometer metallic barcodes.</a> Science. 294, 137-141 (2001).</li><li>JC, H. u. l. t. e. e. n., CR, M. a. r. t. i. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+template-based+method+for+the+preparation+of+nanomaterials.">A general template-based method for the preparation of nanomaterials.</a> J Materials Chem. 7, 1075-1087 (1997).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HotMaster TAQ DNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTP Mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraPure 10X TBE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Persulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEMED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&alpha;-32P-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:ChCl3:IAA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Restriction Enzymes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photographic Film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ECE Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Agarose Beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene Column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaAc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Detroit-551 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SK-MEL-31 cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TrypLE Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sp6 RNA Polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SensiScript Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pCR-2.1-TOPO Vector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DH5&alpha; Compotent Cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector NTI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&gamma;-32P-ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

primer-free aptamer selection using a random dna library

Los aptámeros son oligonucleótidos altamente estructurado (ADN o ARN) que se puede unir a los objetivos con afinidades similares a los anticuerpos 1. Se identifican a través de un proceso de selección in vitro denominado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) para reconocer una gran variedad de objetivos, a partir de moléculas pequeñas de proteínas y otras macromoléculas 2-4. Aptámeros tienen propiedades que son muy adecuadas para el diagnóstico in vivo y / o aplicaciones terapéuticas: Además de una buena especificidad y afinidad, que son fáciles de sintetizar, sobrevivir las condiciones del proceso más riguroso, son poco inmunogénicas, y su tamaño relativamente pequeño puede dar lugar a la penetración fácil de tejidos. Aptámeros que se identifican con el proceso SELEX estándar por lo general comprenden ~ 80 nucleótidos (nt), ya que normalmente se selecciona a partir de bibliotecas de ácidos nucleicos con ~ 40 nt de longitud regiones más al azar sitios fijos de imprimación de ~ 20 nt en cada lado. El primer secuencias fijas por lo tanto puede comprender casi el ~ 50% de las secuencias de la biblioteca, y por lo tanto, positiva o negativamente compromiso identificación de los aptámeros en el proceso de selección de tres, aunque los enfoques bioinformáticos sugieren que las secuencias fijas no contribuyen significativamente a la estructura aptamer después de la selección 5 . Para hacer frente a estos problemas potenciales, primer secuencias han sido bloqueados por oligonucleótidos complementarios o cambiar a mitad de camino diferentes secuencias durante las rondas de SELEX 6, o que han sido recortadas a 6-9 nt 7, 8. Wen y Gray 9 diseñó una cartilla sin método SELEX genómica, en la que el primer secuencias fueron completamente eliminadas de la biblioteca antes de la selección y se regenera entonces para permitir la amplificación de los fragmentos del genoma seleccionado. Sin embargo, para emplear la técnica, una biblioteca genómica única tiene que ser construido, el cual posee una limitada diversidad, y la regeneración después de varias rondas de selección se basa en un paso reamplificación lineal. Por otra parte, los esfuerzos para evitar los problemas causados ​​por primer secuencias fijas con el particionado de alta eficiencia se encuentran con problemas en cuanto a amplificación por PCR 10. Hemos desarrollado un manual gratuito (PF) el método de selección que simplifica los procedimientos de SELEX y efectivamente elimina la interferencia de imprimación problemas 11, 12. Los protocolos de trabajo de una manera directa. La región central al azar de la biblioteca se purifica sin extrañas secuencias de acompañamiento y se une a un objetivo adecuado (por ejemplo, para una proteína purificada o de mezclas complejas, tales como líneas de células). A continuación, las secuencias de atado se obtienen, se reunió con las secuencias de acompañamiento, y re-amplificado para generar seleccionado sub-bibliotecas. Como ejemplo, aquí hemos seleccionado aptámeros para S100B, un marcador de proteína para el melanoma. Los ensayos de unión mostró Kd s en los 10 -7 a 10 -8 M rango después de unas cuantas rondas de selección, y se demuestra que los aptámeros funcionar eficazmente en un formato sándwich vinculante.

Watch this Scientific Journal Video about Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library at JoVE.com

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

SELEX protocolos comprenden múltiples rondas de selección, cada uno de los cuales requieren la regeneración de ligandos unidos, que a su vez requieren secuencias fijas de imprimación que flanquean las regiones de la biblioteca al azar. Estas secuencias de los cebadores fija puede interferir con el proceso de selección (falsos positivos y negativos). Aquí presentamos una cartilla sin protocolo.

Primer Libre Selección aptámero utilizar una biblioteca de ADN al azar

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Investigación

Biología

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

La mejora de la tasa de éxito de cristalización de proteínas por Random Matrix Microseed Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Reducción de gravedad Demostraciones entorno de hardware de un prototipo miniaturizado citómetro de flujo y Compañero Microfluidos Tecnología de mezcla

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...