Name: method for the isolation of francisella tularensis outer membranes
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes at JoVE.com

Проекта, описанного была поддержана номера Грант P01 AI055637 и U54 AI057156 из NIAID / NIH. Ее содержание полностью ложится на авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения RCE программы Office, NIAID, или НИЗ.

<ol>
	<li>Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+in+density+gradients.">Centrifugation in density gradients.</a> , 335-335 (1982).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> J Biol Chem. 247 (12), 3962-3962 (1972).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+outer+membranes.">Isolation of outer membranes.</a> Methods Enzymol. 235, 225-225 (1994).</li><li>Mizuno, T., Kageyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+characterization+of+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Separation and characterization of the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> J Biochem. 84 (1), 179-179 (1978).</li><li>Huntley, J. F., Conley, P. G., Hagman, K. E., Norgard, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Francisella+tularensis+outer+membrane+proteins.">Characterization of Francisella tularensis outer membrane proteins.</a> J Bacteriol. 189, 561-561 (2007).</li><li>Huntley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+outer+membrane+proteins+protect+mice+against+pulmonary+challenge+with+virulent+type+A+Francisella+tularensis.">Native outer membrane proteins protect mice against pulmonary challenge with virulent type A Francisella tularensis.</a> Infect Immun. 76 (8), 3664-3664 (2008).</li><li>Bevanger, L., Maeland, J. A., Naess, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agglutinins+and+antibodies+to+Francisella+tularensis+outer+membrane+antigens+in+the+early+diagnosis+of+disease+during+an+outbreak+of+tularemia.">Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia.</a> J Clin Microbiol. 26 (3), 433-433 (1988).</li><li>Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+proteome+database+of+Francisella+tularensis.">Towards proteome database of Francisella tularensis.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 149-149 (2003).</li><li>Pavkova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+live+vaccine+strain:+proteomic+analysis+of+membrane+proteins+enriched+fraction.">Francisella tularensis live vaccine strain: proteomic analysis of membrane proteins enriched fraction.</a> Proteomics. 5 (9), 2460-2460 (2005).</li><li>Sandstrom, G., Tarnvik, A., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunospecific+T-lymphocyte+stimulation+by+membrane+proteins+from+Francisella+tularensis.">Immunospecific T-lymphocyte stimulation by membrane proteins from Francisella tularensis.</a> J Clin Microbiol. 25 (4), 641-641 (1987).</li><li>Sjostedt, A., Tarnvik, A., Sandstrom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell-stimulating+17-kilodalton+protein+of+Francisella+tularensis+LVS+is+a+lipoprotein.">The T-cell-stimulating 17-kilodalton protein of Francisella tularensis LVS is a lipoprotein.</a> Infect Immun. 59 (9), 3163-3163 (1991).</li><li>Twine, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+tularensis+proteome:+low+levels+of+ASB-14+facilitate+the+visualization+of+membrane+proteins+in+total+protein+extracts.">Francisella tularensis proteome: low levels of ASB-14 facilitate the visualization of membrane proteins in total protein extracts.</a> J Proteome Res. 4 (5), 1848-1848 (2005).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Этот протокол описывает изменение spheroplasting, осмотического лизиса, и сахарозы центрифугирования в градиенте плотности &quot;золотым стандартом&quot; для физического разделения и обогащения грамотрицательные бактериальные ОМС от других клеточных компонентов 2, 3, 4. В то время как мы ранее описанных применение этого метода для выделения OMS с обеих тип и штаммы типа B Ф. tularensis 5, данная презентация предлагает более подробные и оптимизирована процедура изоляции ОМ. Действительно, это важный шаг вперед для выявления потенциально поверхности, подвергшихся воздействию и предполагаемого факторов вирулентности от этой смертельной возбудителя. Значение этой процедуры была продемонстрирована в исследованиях нашей лаборатории показали, что иммунизация мышей с очищенной ПУД предоставляемой существенную защиту против вирулентных типа F. tularensis легочные проблемы 6. Как отмечалось выше, фазы роста бактериальных клеток, необходим тщательный мониторинг во время осмотического лизиса, и нежный ресуспендирования мембраны гранулы важнейших мер, которые появляются, коррелирует с успеха / неуспеха этой процедуры мембранного разделения. Хотя это оптимизированный метод является строгим и при условии соблюдения некоторых экспериментальных изменчивости, в результате OMS-видимому, в высшей степени чистоты расширенной по сравнению с теми получила от использования моющих средств, хлорида лития, натрия или карбонат 7, 8, 9, 10, 11, 12.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Donor calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>35-022-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IsoVitaleX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellgro molecular grade dH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-000-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>38.5 ml polycarbonate bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>010-0514</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>096-087051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>04693132001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DC protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>500-0116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>344060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>331301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Abbe benchtop refractometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-964-10 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis является грамотрицательных внутриклеточных коккобактерия и возбудителя туляремии зоонозных заболеваний. По сравнению с другими бактериальными патогенами, крайне низкой инфекционной дозой (&lt;10 КОЕ), быстрое прогрессирование заболевания, а также высокие показатели заболеваемости и смертности показывают, что вирулентных штаммов Francisella кодирования для новых факторов вирулентности. Поверхность, подвергшихся воздействию молекул, а именно внешнюю мембрану белков (ПУД), было показано, что содействие бактериальной клетки-хозяина, связывание, запись, внутриклеточного выживания, вирулентность и иммунной уклонения. Актуальность для изучения ПУД далее подчеркивается тем фактом, что они могут служить в качестве защитных вакцин против ряда бактериальных заболеваний. Принимая во внимание, ПУД могут быть извлечены из грам-отрицательных бактерий через объемной мембранной экстракции методы, в том числе ультразвуком клеток с последующим центрифугированием и / или моющим средством добычи, эти препараты часто бывают загрязнены с периплазматического и / или цитоплазматические (внутренней) оболочки (IM) загрязняющих веществ. На протяжении многих лет «золотым стандартом» метод для биохимических и биофизических разделения грамотрицательных IM и внешней мембраны (ОМ) в том, чтобы предмет бактерий spheroplasting и осмотического лизиса, а затем сахарозу центрифугирования в градиенте плотности. После слоистые на градиенте сахарозы, OMS может быть отделена от чата на основе различий в плавучей плотности, как полагают, в значительной степени основывается на наличии липополисахарида (ЛПС) в ОМ. Здесь мы описываем строгий и оптимизированный метод для извлечения, обогащения и изоляции F. tularensis внешних мембран и связанных с ними ПУД.

Watch this Scientific Journal Video about Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes at JoVE.com

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Протокол для разделения внутренней и внешней мембраны от<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; По spheroplasting, осмотического лизиса, и сахарозы градиента плотности ультрацентрифугирования.

Метод Изоляция Francisella tularensis Outer Мембраны

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Метод мышь панкреатических островков изоляции и внутриклеточного цАМФ определения

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Выделение новорожденных внепеченочных холангиоцитах

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Быстрой, масштабируемый способ выделения, функционального исследования и анализа клеточного происхождения внеклеточной матрицы

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Стандартный метод стерилизации высок объём Arabidopsis семян

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Привязанные двухслойные липидные мембраны для мониторинга теплопередачи между наночастицами золота и липидными мембранами

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

Метод перфузии Antegrade для выделения кардиомиоцитов у мышей

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...