Name: visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃŽÂ±-actinin by Confocal Imaging at JoVE.com

המחקרים מומנו על ידי האמון Wellcome ודלקת קרום המוח בבריטניה. קו HBMEC תא סופק על ידי ד&quot;ר KS קים. Confocal הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים בוצעו מתקן bioimaging וולפסון, מאוניברסיטת בריסטול. אנחנו רוצים גם להודות למר אלן Leard, ד&quot;ר מארק ג&#39;פסון (אוניברסיטת בריסטול), ומר אלן טילי (PerkinElmer) על עזרתם עצה.

<ol>
	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

האפשרות של קשירת הפנימו OPC-לבטא meningitidis Neisseria ל α-actinin היה בחנו באמצעות HBMEC על ידי בדיקה של colocalisation של חיידקים cytoskeletal החלבון בתאים נגועים לאחר תקופה h 3 ו 8 הדגירה. על ידי מיקרוסקופיה confocal, colocalisation של Neisseria meningitidis עם α-actinin יכול להיות הפגינו. יש לציין, כי חיידקים הופנמו על 3 שעות, היה colocalisation קטנה עם α-actinin בנקודה זו בזמן. העמותה חיידקית עם החלבון cytoskeletal נראה דורשים תקופה ארוכה של מגורים תאיים כמו 8 שעות לאחר תקופה זיהום, מספר משמעותי של חיידקים היו α-actinin כנראה קשר הדוק. Alpha-actinin הוא חלבון רב תכליתיים, ואת האינטראקציות חיידקי עם אלמנט cytoskeletal יכול להיות השפעה משמעותית על תפקוד היעד התא שבו הוא נושא למחקרים הנוכחי. כימות colocalisation כפי שתואר לעיל מחייב הכנת הדגימה מוקפד. תשומת לב מיוחדת יש לתת קיבעון הדגימה, חסימת דילולים התקופה נוגדן. עבור האות הטוב ביותר יחס רעש, נוגדן כל יסודי ותיכון צריכים להיות טיטרציה בניסויים ראשוניים על מנת לקבוע את ריכוז אופטימלי. מניסיוננו, Mowiol בינוני הרכבה הפיק תמונות טובות יותר.

1. לייזר Confocal סריקה מיקרוסקופית (CLSM): Leica SP5 confocal מערכת הדמיה: מערכת זו, באמצעות שילוב של AOTF (acousto אופטי מסנן tuneable) ו AOBS (acousto אופטי קרן splitter), מפשט עירור עם אורכי גל מסוימים. 2-תוכנה: לייקה confocal תוכנה LCS, Leica Microsystems, גרמניה. Volocity 5, אימפרוביזציה, PerkinElmer, ארה&quot;ב.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

החלבון OPC של Neisseria meningitidis (ננומטר, meningococcus) הוא משטח הביע קרום חלבון אינטגרלי החיצונית, אשר יכול לשמש adhesin ו invasin יעיל בתאי אפיתל אנדותל אנושיים. זיהינו אנדותל משטח הממוקם integrins כמו קולטנים מרכזי OPC, תהליך המחייב OPC להיקשר הראשון ligands integrin כגון vitronectin ובאמצעות אלה את התא הביע קולטנים 1. תהליך זה מוביל פלישה של חיידקים לתאי אנדותל 2. לאחרונה, צפינו אינטראקציה של OPC עם חלבון 100kDa למצוא lysates תא שלם של תאים אנושיים 3. בתחילה אנו נצפה זו אינטראקציה כאשר התא המארח חלבונים מופרדים על ידי אלקטרופורזה ומחתה על nitrocellulose היו ועליהן OPC-לבטא Nm. האינטראקציה היתה ישירה ולא לערב מולקולות ביניים. על ידי ספקטרומטריית מסה, הקמנו את זהות החלבון כמו α-actinin. כמו פני השטח לא הביע α-actinin נמצא על כל אחד שורות תאים eight שנבדקו, וכן אינטראקציות עם OPC לתאי אנדותל בנוכחות להוביל בסרום הכניסה חיידקים לתאי יעד, בחנו את האפשרות של שני החלבונים אינטראקציה intracellularly. לשם כך, אדם תרבותי כלי הדם במוח בתאי האנדותל (HBMECs) נדבקו OPC-לבטא Nm לפרקי ואת המיקומים של חיידקים הפנימו ו ​​α-actinin נבחנו על ידי מיקרוסקופיה confocal. צפינו תלוי זמן עלייה של colocalisation Nm עם החלבון cytoskeletal, אשר היה ניכר לאחר תקופה לשעה שמונה internalisation חיידקי. בנוסף, שימוש בתוכנות הדמיה כמותי אפשרה לנו להשיג מידה יחסית של colocalisation של Nm עם α-actinin cytoskeletal וחלבונים אחרים. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה וכימות colocalisation של החיידק עם חלבונים תאיים לאחר כניסת חיידקים לתוך לתאי אנדותל אנושיים, למרות ההליך הוא גם החלים בתאי אפיתל אנושיים.

Watch this Scientific Journal Video about Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃŽÂ±-actinin by Confocal Imaging at JoVE.com

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (ננומטר), שלילי גרם אדם ספציפי פתוגן הנשימה, ניתן לאגד את האדם α-actinin. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה של colocalisation של החיידק עם תאיים α-actinin לאחר כניסת חיידקים לתוך כלי הדם לתאי המוח האנושי האנדותל (HBMECs).

Visualisation וכימות של אינטראקציות תאיים של Neisseria meningitidis ואת האדם α-actinin על ידי הדמיה confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים<em&gt; חיידקי ליסטריה</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

הקרנת אופטי של הרומן חיידקים ספציפיים רגשים על לשעבר Vivo רקמת הריאה האנושית על ידי לייזר קונפוקלי Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...