Name: visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging
Uploaded: 2010-10-24T17:30:00
Duration: 12 min 58 s
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अध्ययन द्वारा वित्त पोषित वेलकम ट्रस्ट और मेनिनजाइटिस ब्रिटेन किया गया. HBMEC सेल लाइन डॉ. के.एस. किम द्वारा प्रदान की गई थी. Confocal इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वोल्फसन Bioimaging सुविधा, ब्रिस्टल विश्वविद्यालय में प्रदर्शन किया गया. हम भी उनकी मदद और सलाह के लिए श्री एलन Leard, डॉ. मार्क Jepson (ब्रिस्टल विश्वविद्यालय), और श्री एलन Tilley (PerkinElmer) को धन्यवाद देना चाहूंगा.

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	<li>Virji, M., Makepeace, K., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+interactions+of+Opc-expressing+meningococci+at+apical+and+basolateral+surfaces+of+human+endothelial+cells;+the+role+of+integrins+in+apical+interactions.">Distinct mechanisms of interactions of Opc-expressing meningococci at apical and basolateral surfaces of human endothelial cells; the role of integrins in apical interactions.</a> Molecular Microbiology. 14, 173-184 (1994).</li><li>Virji, M., Makepeace, K., Peak, I. R., Ferguson, D. J., Jennings, M. P., Moxon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opc-+and+pilus-+dependent+interactions+of+meningococci+with+human+endothelial+cells:+molecular+mechanisms+and+modulation+by+surface+polysaccharides.">Opc- and pilus- dependent interactions of meningococci with human endothelial cells: molecular mechanisms and modulation by surface polysaccharides.</a> Molecular Microbiology. 18, 741-754 (1995).</li><li>Sa E Cunha, C., Griffiths, N. J., Murillo, I., Virji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neisseria+meningitidis+Opc+invasin+binds+to+the+cytoskeletal+protein+alpha-actinin.">Neisseria meningitidis Opc invasin binds to the cytoskeletal protein alpha-actinin.</a> Cellular Microbiology. 11, 384-405 (2009).</li><li>Virji, M., Kayhty, H., Ferguson, D. J., Alexandrescu, C., Alexandrescu, J. E., Heckels, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pili+in+the+interactions+of+pathogenic+Neisseria+with+cultured+human+endothelial+cells.">The role of pili in the interactions of pathogenic Neisseria with cultured human endothelial cells.</a> Molecular Microbiology. 5, 1831-1841 (1991).</li><li>Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+colocalization+of+objects+in+dual+color+confocal+images.">Measurement of colocalization of objects in dual color confocal images.</a> Journal of Microscopy. 6, 357-382 (1993).</li><li>Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+multicolor+confocal+immunofluorescence+microscopy+images:+pushing+pixels+to+explore+biological+phenomena.">Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 40, 101-111 (2007).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

के बंधन की संभावना भली भाँति Opc व्यक्त α-actinin नेइसेरिया meningitidis HBMEC का उपयोग कर जीवाणुओं की colocalisation की परीक्षा और 3 और 8 घंटे ऊष्मायन अवधि के बाद संक्रमित कोशिकाओं में cytoskeletal प्रोटीन द्वारा पता लगाया था . Confocal माइक्रोस्कोपी, α actinin साथ नेइसेरिया meningitidis के colocalisation प्रदर्शन किया जा सकता है . विशेष रूप से, हालांकि बैक्टीरिया 3 घंटे में भली भाँति थे, वहाँ इस समय बिंदु पर α actinin साथ थोड़ा colocalisation था. Cytoskeletal प्रोटीन के साथ बैक्टीरियल संघ 8 घंटे संक्रमण अवधि के बाद के रूप में intracellular निवास की एक लंबी अवधि की आवश्यकता होती दिखाई है, जीवाणुओं की महत्वपूर्ण संख्या α actinin जाहिरा तौर पर निकट सहयोग में. अल्फा actinin एक multifunctional प्रोटीन है, और cytoskeletal तत्व के साथ जीवाणु बातचीत लक्ष्य सेल समारोह, जो वर्तमान अध्ययन का एक विषय है पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. Colocalisation की मात्रा का ठहराव के रूप में ऊपर वर्णित सावधानीपूर्वक नमूना तैयार करने की आवश्यकता है. नमूना निर्धारण करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए, अवधि और एंटीबॉडी dilutions अवरुद्ध. शोर अनुपात करने के लिए सबसे अच्छा संकेत के लिए, प्रत्येक प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी प्रारंभिक प्रयोगों में titrated जाना चाहिए करने के लिए अधिकतम सांद्रता निर्धारित. हमारे अनुभव में, बढ़ते मध्यम Mowiol बेहतर छवियों का उत्पादन किया.

1. Confocal लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (CLSM): Leica SP5 confocal इमेजिंग सिस्टम: इस प्रणाली AOTF (acousto ऑप्टिकल tuneable फिल्टर) का एक संयोजन और एक AOBS (acousto ऑप्टिकल बीम फाड़नेवाला) का उपयोग करके, विशिष्ट तरंग लंबाई के साथ उत्तेजना सरल. 2 सॉफ्टवेयर: Leica confocal सॉफ्टवेयर LCS, Leica माइक्रोसिस्टम्स, जर्मनी. Volocity 5, कामचलाऊ, PerkinElmer, संयुक्त राज्य अमरीका.

visualisation and quantification of intracellular interactions of neisseria meningitidis and human &alpha;-actinin by confocal imaging

Opc प्रोटीन नेइसेरिया meningitidis (एनएम, meningococcus) के एक सतह व्यक्त अभिन्न बाहरी झिल्ली प्रोटीन, जो एक adhesin और मानव उपकला और endothelial कोशिकाओं के लिए एक प्रभावी invasin के रूप में कार्य कर सकते हैं. हम Opc, एक प्रक्रिया है जो vitronectin जैसे integrin ligands के लिए पहली बाँध के लिए OPC की आवश्यकता के लिए प्रमुख रिसेप्टर्स के रूप में और के लिए एक सेल व्यक्त रिसेप्टर्स इन के माध्यम से endothelial सतह स्थित integrins की पहचान की है. इस प्रक्रिया endothelial कोशिकाओं जीवाणु आक्रमण 2 की ओर जाता है है . हाल ही में, हम OPC के एक 100kDa मानव 3 कोशिकाओं के पूरे सेल lysates में पाया प्रोटीन के साथ एक बातचीत मनाया . हम शुरू में इस बातचीत मनाया जब मेजबान कोशिका प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग और nitrocellulose पर blotted OPC-व्यक्त एनएम के साथ मढ़ा गया. बातचीत प्रत्यक्ष था और मध्यवर्ती अणुओं शामिल नहीं है. मास स्पेक्ट्रोमेट्री से, हम α-actinin के रूप में प्रोटीन की पहचान की स्थापना की. के रूप में कोई सतह व्यक्त α-actinin आठ सेल लाइनों की जांच के किसी पर पाया गया था, और लक्ष्य कोशिकाओं में बैक्टीरिया प्रविष्टि के लिए सीरम नेतृत्व की उपस्थिति में endothelial कोशिकाओं के साथ Opc बातचीत के रूप में, हम दो intracellularly बातचीत प्रोटीन की संभावना की जांच की. इस के लिए, सुसंस्कृत मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (HBMECs) से संक्रमित थे Opc व्यक्त विस्तारित अवधि और भली भाँति बैक्टीरिया और α-actinin के स्थानों के लिए एनएम confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई. हम cytoskeletal प्रोटीन है, जो बैक्टीरिया internalisation की एक आठ घंटे की अवधि के बाद काफी था के साथ एनएम के colocalisation में वृद्धि समय पर निर्भर मनाया. इसके अलावा, मात्रात्मक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग हमें प्राप्त करने के लिए α-actinin और अन्य cytoskeletal प्रोटीन के साथ एनएम के colocalisation के एक रिश्तेदार को मापने के लिए सक्षम होना चाहिए. यहाँ हम दृश्य और मानव endothelial कोशिकाओं में बैक्टीरिया प्रविष्टि के बाद intracellular प्रोटीन के साथ जीवाणु के colocalisation की मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, हालांकि प्रक्रिया भी मानव उपकला कोशिकाओं के लिए लागू है.

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Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human ÃƒÅ½Ã‚Â±-actinin by Confocal Imaging

नेइसेरिया (एनएम) meningitidis, एक ग्राम नकारात्मक श्वसन मानव विशिष्ट रोगज़नक़, मानव α-actinin के लिए बाध्य कर सकते हैं . यहाँ हम intracellular मानव मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं (HBMECs) में बैक्टीरिया प्रवेश के बाद α actinin के साथ जीवाणु के colocalisation के दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

विजुअलाइजेशन के intracellular सहभागिता की मात्रा नेइसेरिया meningitidis और Confocal इमेजिंग द्वारा α actinin मानव

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Vacuolar टूटना की सिंगल सेल माप intracellular रोगज़नक़ों की वजह

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Amoebal coculture और Amoebal संवर्धन दृष्टिकोण से नई intracellular रोगज़नक़ों की डिस्कवरी

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

में माइलॉयड कोशिकाओं गतिशीलता की वास्तविक समय इमेजिंग<em&gt; Apc<sup&gt; न्यूनतम / +</sup</em&gt; ट्यूमर आंतों डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

एक filamentous फफूंद कालोनियों पर बैक्टीरियल biofilms के गुणात्मक बहु पैमाने विश्लेषण के लिए नई विधि का उपयोग Confocal और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Virometry प्रवाह virions की प्रतिजनी स्पेक्ट्रा और बाह्य Vesicles का विश्लेषण करने के लिए

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

उपंयास जीवाणुओं के ऑप्टिकल स्क्रीनिंग-फोकल लेजर Endomicroscopy द्वारा विवो मानव फेफड़े के ऊतकों पर विशिष्ट जांच

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा visualizing Intracellular जाल ्े

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

पूर्व वीवो मानव लसीकावत् ऊतक और मादा जननांग म्यूकोसा के मानव इम्यूनो वायरस 1 और Histoculture के साथ संक्रमण

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

सिंगल सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा Efferocytosis की ठहराव

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...