Name: oligo mass profiling (olimp) of extracellular polysaccharides
Uploaded: 2010-06-20T17:00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides at JoVE.com

Эта работа финансировалась грантом OO0G01 Энергия биологических наук Института.

Метод ОЛИМП иллюстрируется на основных гемицеллюлозы присутствующие в клеточных стенках двудольных растений, xyloglucan, используя эндоглюканазы как glycosylhydrolase. Метода продемонстрирована с целыми Arabidopsis рассады в качестве источника ткани растения. Фермент и внеклеточного матрикса материал может быть заменен в зависимости от желаемого анализа с использованием той же процедуры. 1. Изоляции клеточной стенки <ol><li> Урожай пять 5-дневных целом Arabidopsis рассаду или эквивалентное количество желаемый материал и перенести их в 1,5 мл трубки реакции. Убедитесь, что материал находится в нижней части трубы. </li><li> Добавьте два 3 мм металлическими шариками, чтобы реакция трубки в верхней части образца и оснастки заморозить в жидком азоте. </li><li> Grind замороженного образца с помощью шаровой мельницы (2:30 мин, 25 Гц). </li><li> Добавить 1 мл 70% водного раствора этанола в образце. Удалите металлические шарики использованием магнита. Vortex тщательно. </li><li> Центрифуга образца при 14 000 оборотов в минуту в течение 10 минут для осаждения нерастворимых алкоголя остаток, содержащий материал клеточной стенки. </li><li> Осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок. </li><li> Добавить 1 мл хлороформ / метанол (1:1 об / об) решение. Vortex тщательно ресуспендируют гранул. </li><li> Центрифуга образца при 14 000 оборотов в минуту в течение 10 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок. </li><li> Сухой образец с помощью концентратора. </li></ol> 2. Солюбилизация олигосахаридов <ol><li> Для солюбилизации частности полисахарида в форме его олигосахариды ресуспендирования сухих гранул в 25 мкл соответствующего буфера. Для эндоглюканазы 50 мМ формиат аммония, pH4.5, используется. Добавить 0.2U из эндоглюканазы. Vortex подвески и спиновой жидкости вниз. </li><li> Инкубируйте пробы для 16h при 37 ° C в инкубаторе, качая на 300rpm. </li><li> Удаление растворителя из дайджеста (воды) с помощью концентратора. </li></ol> 3. MALDI-TOF анализа выпущен олигосахариды <ol><li> BioRex MSZ 501 катион бисером обмен смолы используются для удаления солей и ферментов из переваривается образца. Условие бисером, помещая аликвоту в пустые колонки и стиральной бисер с большим количеством воды. </li><li> Добавить 5-10 бусин BioRex к переваривается и высушенного образца. Затем добавить 10 мкл воды, на меньшие суммы материальной 5 мкл воды может быть использован. Погрузите бусины в раствор кратко спиннинг трубы. Инкубируйте по меньшей мере 10 мин при комнатной температуре. </li><li> Пятно 2μl матрицы (2,5-диоксибензойной кислоты (DHB), 10mg/ml в воде) на тарелку целевой MALDI. Evaporate матрицы растворителя под вакуумом приводит к однородной кристаллы химического матрицы. </li><li> Пятно 2μl из обессоленной решение образца на вершине матрицы кристаллов на целевой пластины. Если вы хотите обнаружить большое количество образцов только сохранить на кровянистые выделения в течение не более 3 мин. Это временные рамки гарантирует, что первый образец пятнистый не сухой еще. Дождитесь дополнительных 2min для обеспечения тщательного перемешивания снова растворяли матрицы и образца олигосахарид молекул в последней выборки пятнами. Затем высушите визирной пластины в вакууме. Выборки / матрицы смесь должна кристаллизоваться менее чем за 1 мин включить однородной кристаллизации. </li><li> Место визирной в MALDI-TOF масс-спектрометра. Машина должна быть установлена ​​в положительном рефлектрон режиме с ускоряющим напряжением 20000V и задержка 350 нм; выбранном диапазоне масса должна быть 500-3000 Da (может меняться в зависимости от ожидаемого олигомеров). Начало стрельбы лазера и собирать 100-200 спектров в образце, которые составляются для получения представителем спектр средней (рис. 2А). Ионы представляющие конкретные олигосахариды можно определить по их массе по обвинению (м / г) отношение. Ионной интенсивности (высота пика) всех ионов интересов должны быть добавлены до 100% в результате относительного обилия каждого олигосахарид в образце (рис. 2В). </li></ol> 4. Натурные анализ ОЛИМП ОЛИМП также может быть использована непосредственно на ткани минуя какие-либо шаги стене подготовки. В качестве примера этиолированных гипокотиля арабидопсиса как источник растительных тканей используются. Опять же, эндоглюканазы используется для определения структуры xyloglucan гемицеллюлоз. Фермент и тканевого материала могут быть заменены в зависимости от желаемого анализа, используя ту же процедуру. <ol><li> Урожай этиолированных рассады и поместить его на пустую тарелку целевой MALDI и пусть рассаду сухими. </li><li> Добавить 0.5μl эндоглюканазы (0.4U/μl, растворенного в 50 мМ формиат аммония, pH4.5) на сушеные рассады в нужное положение. Убедитесь, что фермент падение коснется частично целевой пластины. </li><li> Место пластины MALDI мишени в закрытом контейнере с насыщающей влажности, чтобы избежать этого фермента капля высыхает. Инкубируйте пластины в камере в течение 16ч при температуре 37 ° C. </li><li> Сухие пластины MALDI мишени с ткани растений и ферментов падение в вакууме. </li><li> Добавить 0.5μl матрицы (DHB; 10 мг / л) друг на сушеные месте фермента. Оставьте на 2 минуты. </li><li> Сухие пластины MALDI мишени под вакуумом. </li><li> Анализ образцов с MALDI-TOF. Место целевой пластина с тканью и фермента / матрицы месте (ы) в MALDI-TOF масс-спектрометра. Машина должна быть установлена ​​в положительном рефлектрон режиме с ускоряющим напряжением 20000V и задержка 350 нм; выбранном диапазоне масса должна быть 500-3000 Da (может меняться в зависимости от ожидаемого олигомеров). </li><li> Начало стрельбы лазер на матрицу / образец кристаллов Рядом с ткани. Убедитесь, что вы не попали в самой ткани, так как в таком случае времени полета молекул будет отключен. Сбор около 20-50 спектров в месте, которые составляются для получения представителем спектр средней (рис. 3). Ионы представляющие конкретные олигосахариды можно определить по их массе по обвинению (м / г) отношение. Ионной интенсивности (ионных высота) могут быть представлены и все ионы интереса должно быть добавлено до 100% в результате относительного обилия каждого олигосахариды в образце. </li></ol> 5. Представитель Результаты Примером ОЛИМП анализ xyloglucan гемицеллюлозы присутствует в Arabidopsis саженцев показано на рисунке 2. Из-за разности масс ионов и хорошо известны характеризуется фермента (эндоглюканазы) специфичность ионы могут быть закреплены за конкретными олигосахарид структур (рис. 2А). Очевидно, структурных изомеров не отличаются. Основное предположение, для определения относительного содержания различных олигосахаридов (Рис. 2Б) является то, что их масса спецификации ответ фактор очень похож на тех, олигосахаридов. Как показано здесь, ОЛИМП количественная высокой воспроизводимостью. Тем не менее, следует учитывать, что надежность метода очень сильно зависит от сигнала к шуму различных олигосахаридов ионов. Например загрязнения солями или меньшие количества олигосахаридов может уменьшить этот коэффициент. ОЛИМП анализ на самой ткани (на месте анализ) позволяет изучать очень маленькие и определенных областях и включает в себя очень мало пробоподготовки. В примере, приведенном здесь (рис. 3) никаких качественных (то же, ионов), но количественные различия (изменение интенсивности ионного) наблюдались между побега и корня-ткани Arabidopsis рассады. Перестановки ОЛИМП-метод может таким образом привести к ткани &quot;изображения&quot;. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Блок-схема процедуры с использованием ОЛИМП целом саженцев Arabidopsis как растение источника. Во-первых, ткань вымоченных и материальных клеточная стенка готова (картинка редактировался Фуджино и соавт. 10). Затем олигосахариды частности полисахарид стены выпускаются с использованием специального гидролазы. Наконец, относительного содержания растворимых олигосахаридов, определяются с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Относительное обилие xyloglucan олигосахариды в этиолированных сеянцы из Arabidopsis, как это определено ОЛИМП. ) Представитель xyloglucan олигосахарид масс-спектр, каждый ион представляет определенный олигосахарид структуры, структурных изомеров не могут быть выделены. Б) соответствующая диаграмма бар для определения относительной олигосахарид изобилии. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Натурные анализ ОЛИМП использованием этиолированных проростков арабидопсиса в качестве примера. Каждый фермент / пищеварение капли (цветные круги) могут быть проанализированы самостоятельно и соответствующие спектры масс могут быть получены и проанализированы. <img src="/files/ftp_upload/2046/2046fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. ОЛИМП спектр гемицеллюлозы ксилан получены путем переваривания Miscanthus листа материала с ксиланазы (Megazyme).

<ol>
	<li>Lerouxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+structural+phenotyping+of+plant+cell+wall+mutants+by+enzymatic+oligosaccharide+fingerprinting.">Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting.</a> Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanalysis+of+plant+cell+wall+polysaccharides.">Microanalysis of plant cell wall polysaccharides.</a> Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).</li><li>Mouille, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+loci+analysis+of+primary+cell+wall+composition+in+Arabidopsis.">Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).</li><li>Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+suite+of+polysaccharide-degrading+enzymes+for+analyzing+plant+cell+walls.">Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls.</a> PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+xyloglucan-specific+endo-beta-1,4-glucanase+from+Aspergillus+aculeatus:+expression+cloning+in+yeast,+purification+and+characterization+of+the+recombinant+enzyme.">A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme.</a> Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).</li><li>Aboughe-Angone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+carbohydrates+from+fruit+pulp+of+Argania+spinosa:+structural+analysis+of+pectin+and+xyloglucan+polysaccharides.">Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides.</a> Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).</li><li>Brown, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+five+xylan+synthesis+mutants+reveals+new+insight+into+the+mechanisms+of+xylan+synthesis.">Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis.</a> Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).</li><li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARVUS+gene+is+expressed+in+cells+undergoing+secondary+wall+thickening+and+is+essential+for+glucuronoxylan+biosynthesis.">The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis.</a> Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).</li><li>Obel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+may+hinder+the+unfolding+of+xyloglucan+chains+during+cell+deformation:+implications+of+the+mechanical+performance+of+Arabidopsis+hypocotyls+with+pectin+alterations.">Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations.</a> Molecular Plant . , (2009).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Leonard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Arabidopsis+gene+encoding+a+GH95+alpha1,2-fucosidase+active+on+xyloglucan+oligo-+and+polysaccharides.">Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides.</a> Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).</li><li>Cavalier, D. M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+xyloglucan+xylosyltransferases+catalyze+the+addition+of+multiple+xylosyl+residues+to+cellohexaose.">Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).</li><li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+irregular+xylem9+mutant+is+deficient+in+xylan+xylosyltransferase+activity.">The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity.</a> Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).</li><li>Iglesias, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+glycosidases+active+against+xyloglucan+oligosaccharides+of+Arabidopsis+thaliana.">Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana.</a> Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).</li><li>Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cross-links+between+cellulose+microfibrils,+and+their+occurrence+during+elongation+growth+in+pea+epicotyl.">Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl.</a> Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).</li><li>Vanzin, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mur2+mutant+of+Arabidopsis+thaliana+lacks+fucosylated+xyloglucan+because+of+a+lesion+in+fucosyltransferase+AtFUT1.">The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1.</a> PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).</li><li>Cavalier, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+two+Arabidopsis+thaliana+xylosyltransferase+genes+results+in+plants+deficient+in+xyloglucan,+a+major+primary+cell+wall+component.">Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component.</a> Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).</li><li>Hilz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+liquid+chromatography,+capillary+electrophoresis,+and+mass+spectrometry+methods+to+determine+xyloglucan+structures+in+black+currants.">A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants.</a> Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).</li><li>Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214 (1), 67-67 (2001).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

ОЛИМП метод, представленный здесь дает очень чувствительный и быстрый анализ полимеров, присутствующих в внеклеточных матриц. ОЛИМП сочетает ферментативного освобождения олигомеров с последующим MALDI-TOF анализа. Поколение MALDI-TOF спектр занимает менее одной минуты, поэтому ОЛИМП подходит для широкого спектра приложений, включая высокую пропускную способность исследования, такие как мутант экранов. ОЛИМП не ограничивается растительных полисахаридов, но потенциально могут быть применены к широкому кругу полимеров, ограничивается только наличием конкретных гидролитических ферментов. Тем не менее, ограничение ОЛИМП является то, что абсолютное изобилие полимера не могут быть получены. Как упоминалось ранее ОЛИМП могут быть использованы для изучения структуры различных полисахаридов присутствует в внеклеточного матрикса разнообразия видов. В качестве примера, на рисунке 4 представлена ​​ОЛИМП спектр основных гемицеллюлозы в траве видов, ксилан. Здесь, клеточная стенка материал, полученный из травы умеренных Miscanthus расщепляли использованием ксиланазы.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>37550</td>
<td>10mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>BioRex MSZ 501(D) Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>142-7425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endoglucanase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Megazyme</td>
<td>E-CELTR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylanase M6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Megazyme</td>
<td>E-XYRU6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3mm metal balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>22.455.0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beat mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Retsch</td>
<td>Mixer Mill MM400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI-TOF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shimadzu BioTech</td>
<td>Axima Performance</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MALDI target plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kratos Analytical</td>
<td>DE4555TA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpeedVac</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>Vacufuge 5301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MSVMHTS00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Welch</td>
<td>DryFast Ultra 2032</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

oligo mass profiling (olimp) of extracellular polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

Watch this Scientific Journal Video about OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides at JoVE.com

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

Быстрый способ описан, чтобы получить полное представление о структуре полисахаридов в внеклеточного матрикса. Метод использует специфику glycosylhydrolases и чувствительности масс-спектрометрия позволяет незначительное количество материалов для анализа. Этот метод можно адаптировать для использования непосредственно на самой ткани.

Oligo массовой Профилирование (ОЛИМП) из внеклеточных полисахаридов

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Research

JoVE Journal

Biology

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

Антитела профилирования по люциферазы Системы Иммунопреципитация (LIP)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Профилирование метилтрансферазы и других S-Аденозил- L-Гомоцистеин-связывающих белков Захват соединения масс-спектрометрия (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell транскрипции Профилирование взрослых кардиомиоцитов мышь

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Профилирование тиоловых Редокс Протеом Использование изотопной масс-спектрометрии тегов

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Анализ инициации трансляции во время стресса кондиций полисом профилирования

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Сотовая редокс-профилирование с использованием высококонцентрированной микроскопии

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...