Name: measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

保健研究、カナダの白血病とリンパ腫協会とカナダのリンパ腫財団のカナダの協会からの補助金によって支え。

試薬を準備する注：すべてのPBSは、Ca 2 +およびMg 2を含む+ <ol><li>検出試薬 室温のPBSに20μM7 - アミノ-4 - クロロメチルクマリン、T - BOC -ロイシン - メチオニンアミド（BOC - LM - CMAC）を追加します。各細胞懸濁液は、2mLの検出試薬が必要になります。 </li><li> 1％パラホルムアルデヒド（固定セル） 室温のPBS中4％パラホルムアルデヒドのスト?...

<ol>
	<li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li><li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells.">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li><li>Leloup, L., Daury, L., Maz&#233;res, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+ERK/MAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration.">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li></ol>

固定と生活32Dkit細胞におけるカルパイン活性はこのビデオのプロトコルで決定されている。カルパイン阻害剤PD150606を有する細胞系の治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。さらに、MEK1阻害剤PD98059による治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。 ERKは、カルパイン- 2 3の主要な活性剤です。これらの結果は、カルパイン- 2活性が32Dkit細胞で?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>PD150606</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.</td>
</tr>
<tr>
<td>PD98059</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LSR II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry

カルパインは、ユビキタス細胞、カルシウム感受性、中立的なシステインプロテアーゼです。<sup&gt; 1</sup&gt;。カルパインは、シグナル伝達、細胞骨格のリモデリング、遺伝子発現の調節、アポトーシスや細胞周期の進行を含め、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす<sup&gt; 1</sup&gt;。カルパインは、筋ジストロフィー、癌、糖尿病、アルツハイマー病や多発性硬化症を含む多くの病理に関与している<sup&gt; 1</sup&gt;。カルパイン規制は複雑で、完全には理解です。 mRNAおよびタンパク質レベルでは、カルパイン活性を測定するための遺伝子またはタンパク質の発現技術の使用を制限し、活動にあまり相関しない。このビデオのプロトコルの詳細については、固定および生細胞中のカルパイン活性を測定するための我々の研究室では、フローサイトメトリーアッセイを開発した。このメソッドは、カルパインにより特異的に切断される蛍光基質BOC - LM - CMACは、、カルパイン活性を測定するために使用します。<sup&gt; 2</sup&gt;このビデオでは、固定および生体マウス32Dkitの白血病細胞、単独で、または脾細胞集団の一部としてのカルパイン活性はLSRII（BDバイオサイエンス）を用いて測定されます。 32Dkit細胞は、正常脾細胞と比較して上昇活性を有することが示されている。

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

この記事では、フローサイトメトリーを用いて固定し、生きた細胞内のカルパイン活性を測定するための詳細プロトコルを務める。

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

フローサイトメトリーを用いた赤血球補体受容体1の測定

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...