Name: measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Suportada por concessões do Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society do Canadá e da Fundação Linfoma do Canadá.

Prepare Reagentes Nota: Todos os PBS contém Ca 2 + e Mg 2 + <ol><li> Reagente de detecção Adicionar 20Hm 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-Leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensão de células exigirá reagente de detecção 2 ml. </li><li> Paraformaldeído 1% (células fixas) Diluir solução stock 4% paraformaldeído em PBS à temperatura ambiente. Paraformaldeído 1mL alíquota de 1% a cada tubo FACS. Trê...

<ol>
	<li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li><li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells.">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li><li>Leloup, L., Daury, L., Maz&#233;res, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+ERK/MAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration.">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li></ol>

A atividade de calpaína em células 32Dkit fixa e vivendo foi determinado neste protocolo de vídeo. Tratamento da linhagem de células com o inibidor de calpaína PD150606 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. Além disso, o tratamento com o inibidor MEK1 PD98059 resultou em inibição total da atividade calpaína nas células. ERK é um ativador principal de calpaína-2 3. Estes resultados sugerem que calpaína-2 é a atividade predominante nas células 32Dkit. Trabalhos em curs...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>PD150606</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.</td>
</tr>
<tr>
<td>PD98059</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LSR II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry

Calpaínas são onipresentes intracelular, cálcio-sensíveis, cisteína proteases neutras<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas desempenham um papel crucial em muitos processos fisiológicos, incluindo a sinalização, remodelação do citoesqueleto, a regulação da expressão gênica da apoptose e progressão do ciclo celular<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas tem sido implicado em muitas patologias, incluindo distrofias musculares, câncer, diabetes, doença de Alzheimer e esclerose múltipla<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaína regulamentação é complexo e incompletamente compreendida. níveis de mRNA e proteína correlacionam mal com a atividade, limitando o uso de técnicas de expressão do gene ou proteína para medir a atividade calpaína. Esta detalhes protocolo de vídeo de um ensaio de citometria de fluxo desenvolvido em nosso laboratório para medir a atividade das calpaínas em células fixas e de viver. Este método usa o substrato fluorescente BOC-LM-CMAC, que é clivada especificamente pela calpaína, para medir a atividade calpaína.<sup&gt; 2</sup&gt; Neste vídeo, calpaína atividade em fixos e células vivas 32Dkit murine leukemia, sozinho ou como parte de uma população esplenócitos é medida usando um LSRII (BD Bioscience). Células 32Dkit mostraram que têm atividade elevada em comparação com esplenócitos normal.

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Este artigo irá detalhar o protocolo para medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Imunologia e Infecção

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Medindo Anexo e Internalização do Vírus da Influenza A em células A549 por citometria de fluxo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Medição de phagocitose de Aspergillus fumigatus Conidia por Leukocytes Humanos usando citometria flow

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Medição do receptor complemento eririotcyte 1 usando citometria de fluxo

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...