Name: measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la leucemia y el linfoma de la Sociedad de Canadá y la Fundación Linfoma de Canadá.

Preparar los reactivos Nota: Todas las PBS contiene Ca 2 + y Mg 2 + <ol><li> Detección de los reactivos Añadir 20μM 7-amino-4-clorometil cumarina, t-BOC-leucina-metionina amida (BOC-LM-CMAC) a temperatura ambiente PBS. Cada suspensión de células se requieren reactivos de detección de 2 ml. </li><li> Paraformaldehído al 1% (células fijas) Diluir al 4% de paraformaldehído en solución de reserva temperatura ambiente PBS. Alícuota de 1 ml de paraf...

<ol>
	<li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li><li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells.">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li><li>Leloup, L., Daury, L., Maz&#233;res, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+ERK/MAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration.">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li></ol>

La actividad de la calpaína en células 32Dkit fijos y la vida se ha determinado en este protocolo de vídeo. El tratamiento de la línea de células con el inhibidor de la calpaína PD150606 dio lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. Además, el tratamiento con el inhibidor de MEK1 PD98059 dado lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. ERK es un importante activador de la calpaína-2 3. Estos resultados sugieren que la calpa?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>PD150606</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.</td>
</tr>
<tr>
<td>PD98059</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LSR II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry

Calpaínas son omnipresentes intracelular, sensible calcio, cisteína proteasas neutras<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas juegan un papel crucial en muchos procesos fisiológicos, incluida la señalización, la remodelación del citoesqueleto, la regulación de la expresión génica, la apoptosis y la progresión del ciclo celular<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaínas han sido implicados en muchas patologías como distrofias musculares, cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpaína regulación es compleja y no completamente entendido. los niveles de ARNm y proteínas se correlacionan poco con la actividad, lo que limita el uso de las técnicas de la expresión de genes o proteínas para medir la actividad de la calpaína. Esta detalles del protocolo de vídeo un ensayo de citometría de flujo desarrollado en nuestro laboratorio para medir la actividad de la calpaína en células fijadas y de vida. Este método utiliza el sustrato fluorescente BOC-LM-CMAC, que se escinde específicamente por la calpaína, para medir la actividad de calpaína.<sup&gt; 2</sup&gt; En este video, la actividad de la calpaína en fijo y que viven las células murinas 32Dkit leucemia, solo o como parte de una población de esplenocitos se mide utilizando un LSRII (BD Bioscience). 32Dkit células han demostrado tener actividad elevada en comparación con esplenocitos normales.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Este artículo detallará el protocolo para la medición de la actividad de la calpaína en células fijadas y la vida mediante citometría de flujo.

Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Investigación

Inmunología e Infección

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Medición de apego y Internalización del Virus de la Influenza en células A549 por Citometría de Flujo

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

Medición del receptor de complemento de eritrocitos 1 mediante citometría de flujo

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...