Name: chromatin immunoprecipitation (chip) to assay dynamic histone modification in activated gene expression in human cells
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת וירג&#39;יניה, אוניברסיטת וירג&#39;יניה Cancer Center ו פ תומאס קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון. אנו מודים E. ג&#39;יימס דרנל מעבדה (אוניברסיטת רוקפלר) רוס רוברט לאב (אוניברסיטת פורדהם) של שורות תאים.

תכנון יום לפני ניסוי השבב המתוכנן, התאים צריכים להיות מתורבת, כך מספר מספיק זמין. נניח כי כל CHIP assay ידרוש ~ 1-1.5 7 x 10 תאים. תמיד מתכנן לעשות הן שליליות (IgG) חיובי (נוגדן היסטון מחבת) בקרות ניסויים כפולים. עצה - עבור תאים ...

<ol>
	<li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling:+Stats:+transcriptional+control+and+biological+impact.">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li><li>Bromberg, J., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function.">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li><li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma:+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases.">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li><li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histones:+annotating+chromatin.">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Modifications+and+Their+Function.">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+the+histone+code.">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li><li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification.">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li><li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences.">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li><li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activities+of+IRF-1.">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li><li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neuroblastoma+stem+cells.">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li></ol>

פרוטוקול שבב התווה שימש בהצלחה במעבדה כדי assay יותר מעשרים שינויים היסטון אחרת. בנוסף, יש לנו מאופיין בשינויים התפוסה של גורמי שעתוק, היסטון, שינוי אנזימים, חלבונים המזהים שינויים היסטון ואת השנייה RNA פולימראז מכונות שעתוק, בכמה IFN-γ גנים המושרה. השתמשנו גם את ההליך כדי ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>37% Formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP531-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform/Isoamyl alcohol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>AC32715-5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete Mini Protease Inhibitors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1836153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cosmic Calf Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30087.04N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D0632</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP118-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmco</td>
<td>zp1110EP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>100149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>901393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3784</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IFN-gamma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>285-IF-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immunoresearch</td>
<td> 109-005-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biologicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4408</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP333-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deoxycholic Acid Sodium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP349-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>7647-14-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NP40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>US Biological</td>
<td>N3500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Histone H3, CT, pan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>07-690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol/chloroform/isoamyl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>108-95-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>7647-14-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>50-230-0316</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>2500140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5-Prime</td>
<td>2500130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP166-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5941</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>327372500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-K36me3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab9050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-STAT1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-345X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-RNA Polymerase II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-899</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation (chip) to assay dynamic histone modification in activated gene expression in human cells

בתגובה במגוון ligands תאית, STAT (מתמר אותות activator של שעתוק) גורמי תעתוק מגויסים במהירות ממצב רדום בציטופלסמה שלהם על פני הקולטנים בתא שבו הם מופעלים על ידי זרחון על שיירי טירוזין יחיד 1. לאחר מכן הם dimerize ו translocate לגרעין לכונן שעתוק של גני מטרה, להשפיע, צמיחה בידול, הומאוסטזיס ואת התגובה החיסונית. באופן לא מפתיע, בהתחשב מעורבות נרחבת שלהם תהליכים בתא נורמלי, dysregulation של הפונקציה STAT תורם למחלות האדם, במיוחד סרטן מחלות אוטואימוניות 2 ו 3. היא מבוססת היטב כי שעתוק מווסתת על ידי שינויים לתבנית הכרומטין 4,5. שינויים אלה כוללים את הפעילות של ה-ATP תלוי קומפלקסים, כמו גם השינויים היסטון קוולנטיים ו מתילציה בדנ&quot;א 6. בגלל הפעלת STAT של ביטוי גנים הוא גם מהיר חולף, זה דורש מנגנונים ספציפיים עבור התבנית ויסות הכרומטין ב STAT תלויי לוקוסים גן. כדי להגדיר מנגנונים אלה, אנו לאפיין את השינויים היסטון והפעילות האנזימטית שיוצרים אותם לוקוסים גן להגיב איתות STAT. פרוטוקול זה מתאר הכרומטין immunoprecipitation, שיטה כי הוא בעל ערך לחקר STAT איתות הכרומטין ביטוי גנים מופעלים.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

אלל ספציפי Gene Expression Assay כדי לבדוק את בסיס פונקציונלי של אגודות גנטי

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...