Name: how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00
Duration: 9 min 27 s
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Nous tenons à remercier les membres du groupe de Potter pour fournir des commentaires précieux sur le protocole. Ce travail a été financé par une bourse de formation en recherche clinique de l&#39;American Academy of Neurology Foundation pour la CMH, une bourse de l&#39;Institut national des sciences médicales générales (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) à JDR (GM08169 ), une subvention de l&#39;Institut national du NIH des troubles neurologiques et des maladies (NS054809), une Ruth L. Kirschstein National Service Award de la recherche à JDR (NS060392), une provision EFRI subvention (0.836.017), le Prix de la Fondation de recherche translationnelle Coulter, et un bourse de recherche translationnelle au JDR (NS007480).

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	<li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies.">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li><li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+thick+brain+slices:+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability.">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task.">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li><li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+networks+of+cortical+neurons.">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li><li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks.">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li><li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings.">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li><li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks.">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li><li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+plasticity+in+cortical+assemblies.">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li><li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays:+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration.">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li><li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+(1-42)+peptide+concentrations.">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li><li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies.">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li><li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density:+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen.">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li><li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates.">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li><li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy.">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li><li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts.">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays,+with+real-time+control.">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li><li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks.">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li><li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures.">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting.">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks.">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation.">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li><li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons.">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li></ol>

CMH a rien à révéler.<br /&gt; JDR et SMP sont des consultants payés par Axion Biosystems.<br /&gt; Les frais de soumission et les frais de traitement vidéo pour cet article et la vidéo ont été gracieusement parrainée par systèmes multi-canaux.

Ce protocole indique des instructions sur la façon de la culture et maintenir des réseaux neuronaux sur des micro-électrodes sont aussi des tableaux comme une introduction à l&#39;enregistrement et la stimulation des réseaux neuronaux. Quelques-uns des problèmes les plus courants lors de l&#39;enregistrement d&#39;AME ont également été discutés dans la section MEA dépannage. Il ya des variations occasionnelles dans le protocole tel que discuté tout au long et souvent ces changements sont utilisées pour optimiser les conditions spécifiques prévues par certains modèles expérimentaux. Bien que le système d&#39;enregistrement et stimulantes présentées ici se compose de notre personnalisées conçues NeuroRighter 15 avec le préampli MCS, il existe plusieurs autres systèmes qui peuvent fournir une interface avec les réseaux neuronaux. Choisir une configuration particulière dépendra des besoins spécifiques d&#39;expérimentation. L&#39;enregistrement et des exemples simplistes de stimulation ont été fournis dans le présent protocole Cependant ces cultures sur les AME peuvent être utilisés pour fournir un aperçu des questions complexes sur l&#39;activité synaptique et la connectivité réseau neuronal. Comme mentionné ci-dessus, le travail en cours est l&#39;utilisation de cette technologie pour étudier les processus comme la plasticité cellulaire, le développement, l&#39;excitotoxicité et la neurodégénérescence. 6-10 Par exemple, une publication récente de notre laboratoire ont montré l&#39;objectif reproductibles apprentissage dirigé in vitro, en temps réel la stimulation en boucle fermée en réponse à l&#39;activité actuelle du réseau neuronal 3. Bien que les cultures sont souvent capricieux MEA et délicat, grâce à leur simplicité et leur accessibilité (par rapport aux animaux intacts), ils fournissent un puissant modèle pour étudier l&#39;activité neuronale au niveau du réseau.

Fournitures <ul><li> Bouchon de bouteille jetable filtre (150ml, la taille des pores 0,2 um; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embryonic jour 18 chronométrés enceintes rat femelle </li><li> Matrices de microélectrodes (voir description dans le protocole, B1) </li><li> Couvercles matrice de microélectrodes (voir description dans le protocole, B3) </li><li> Cellulaire Nylon crépine (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polypropylène fioles coniques (stérile, 15ml) </li><li> Polystyrène boîtes de Pétri (stérile, 35mm et 100x15mm) </li><li> Embouts de pipettes (stérile, 20 pi, 200 pl et 1000μl) </li><li> Pipettes sérologiques (5ml) </li></ul> Equipement: <ul><li> Hotte à flux biologiques de sécurité armoire / laminaire </li><li> Compteur de cellules </li><li> Centrifugeuse </li><li> Conteneur de glace </li><li> Des ciseaux et des pinces à disséquer (stérilisés) </li><li> Dissection microscope dans une hotte à flux laminaire </li><li> Handheld électriques Pipetman </li><li> Hémacytomètre </li><li> Isofluorane et la chambre à gaz </li><li> Microscope à lumière </li><li> Handheld Pipetman (P-20 (20 pi), P-200 (200 pl), P-1000 (1000μl)) </li><li> Système d&#39;enregistrement AME (voir description dans le protocole, D1) </li><li> Guillotine rongeurs </li><li> Tri-Gas incubateur (voir description dans le protocole, B15) </li><li> Fiole à vide avec aspirateur attaché dans la hotte </li><li> Vortex </li><li> Bain-marie (35-37 ° C) </li></ul> Solutions et réactifs: Solution de BSA: Faites 5% de BSA (Sigma A-9418) dans un tampon phosphate salin pH de 7,4 et filtrée à 0,2 um. Cette solution peut être préparée à l&#39;avance et stocké à 4 ° C pendant plusieurs mois. Milieu cellulaire: Combinez 90 ml de milieu de Dulbecco modifié Eagle (Irvine Scientific 9024), 10 ml de sérum de cheval (Gibco 16050), le pyruvate de sodium 1 ml (100mm, Gibco 11360), 250 pi glutamax (Gibco 35050) et l&#39;insuline (concentration finale 2,5 pg / ml, Sigma I-5500), puis passer à travers une épaisseur de 0,2 um filter.22 chaud et équilibrer le milieu cellulaire dans l&#39;incubateur avant de l&#39;utiliser. Solution de dissection pour préparer la solution de papaïne: 23 <table border="1"><tr><td> Solution de dissection (100ml stock) </td><td> Mélanger dans l&#39;ordre, filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Composante </td><td> Volume ml </td><td> Concentration finale (mM) </td></tr><tr><td> Eau bidistillée </td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mm </td></tr><tr><td> 1 M de CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mM </td></tr><tr><td> 0,5 M HEPES </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% de rouge de phénol </td><td> 0.2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> NaOH 0,1 N </td><td> 0.2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4.5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M d&#39;acide Kynurenic </td><td> 1.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1.0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Cette solution peut être préparée à l&#39;avance et stocké à 4 ° C pendant plusieurs mois. DNAse I: Invitrogen (# 18047019). Aliquotes 50 pl sont surgelés et conservés à -80 ° C. Un aliquot est décongelé dans la hotte à flux laminaire avant de commencer le processus de dissociation cellulaire. Hank solution salée équilibrée: Sigma (# 4891). Une solution 1X est préparé dans de l&#39;eau déminéralisée, stérile filtré à 0,2 um et stocké à 4 ° C. Solution de Hibernate: Préparer le jour de culture. Combinez 98 ml milieu L-15 (Invitrogen 11415) avec 2 ml B-27 supplément (50X, Invitrogen # 17504) et le filtre à 0,2 um. Solution de laminine: Préparer le jour de culture. Diluer 20 pi de la laminine (1mg/ml, Sigma L-2020) dans le milieu cellulaire 980 ul pour une concentration finale de 0.02mg/ml. Aliquotes de 20 pl de la laminine (1mg/ml) sont stockés à -80 ° C et décongelées juste avant utilisation. La décongélation doit se faire sur la paillasse et non pas dans le bain d&#39;eau aussi rapide dégel peut parfois conduire à une gélification de la laminine. Solution de papaïne: 23 Chaude 10 ml de solution de dissection (ci-dessus) à 30-32 ° C. Ajouter 200 unités papaïne (Sigma P-4762) et 1,6 mg de L-cystéine (Sigma C-7880). Ajuster le pH à 7,4 avec environ 14 ul de 0,1 N NaOH. Incuber pendant 30 minutes environ jusqu&#39;à ce que la solution cloreilles, filtre de 0,2 um, gel flash avec l&#39;azote liquide dans aliquots de 2 ml dans 15 ml polypropylène stériles fioles coniques et stocker à -80 ° C. Dégeler une aliquote à 35-37 ° C avant de commencer le protocole. Polyéthylèneimine (PEI) solution: 13 100 ul de PEI (50% p / v, Sigma P-3143) est dilué dans 100 ml de tampon borate de sodium (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) pour une concentration finale de 0,05% p / v. Filtre stérile à 0,2 um. Ceci peut être préparé à l&#39;avance et stocké à 4 ° C pendant des mois. Stérile de l&#39;eau déminéralisée: Autoclave et laisser refroidir à température ambiante avant utilisation. La trypsine (0,25% avec de l&#39;EDTA, Gibco 25200): Aliquotes de 1ml sont surgelés et conservés à -80 ° C. Aliquotes sont décongelés dans le bain 35-37 ° C l&#39;eau avant utilisation.

how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)

Pour le siècle dernier, les neuroscientifiques nombreuses régions du monde ont consacré leur vie à comprendre comment les réseaux de neurones fonctionnent et pourquoi ils arrêtent de travailler dans diverses maladies. Des études ont inclus l&#39;observation neuropathologique, la microscopie fluorescente avec marquage génétique, et l&#39;enregistrement intracellulaire dans les deux neurones dissociés et préparations tranche. Ce protocole traite d&#39;une autre technologie, qui consiste à cultiver des cultures dissociées de neurones sur la micro-électrode tableaux (également appelé réseau d&#39;électrodes multiples, AME). Il ya de multiples avantages à utiliser ce système sur d&#39;autres technologies. Dissocié cultures neuronales sur les AME fournissent un modèle simplifié dans lequel l&#39;activité du réseau peut être manipulé avec des séquences de stimulation électrique par électrodes multiples du tableau. Parce que le réseau est faible, l&#39;impact de la stimulation est limitée aux zones observables, ce qui n&#39;est pas le cas dans les préparations intactes. Les cellules se développent dans une monocouche faire des changements dans la morphologie facile à suivre avec les diverses techniques d&#39;imagerie. Enfin, les cultures sur les AME peuvent survivre pendant plus d&#39;un an in vitro, ce qui supprime toute limite temporelle claire inhérents aux techniques de culture d&#39;autres 1. Notre laboratoire et d&#39;autres autour du globe utilisent cette technologie pour poser des questions importantes au sujet des réseaux neuronaux. Le but de ce protocole est de fournir les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l&#39;enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME. Dans les réseaux in vitro fournissent un moyen pour poser des questions pertinentes physiologiquement au niveau du réseau et des niveaux cellulaires conduisant à une meilleure compréhension des la fonction cérébrale et un dysfonctionnement.

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How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Ce protocole fournit les informations nécessaires à la mise en place, le soin, l&#39;enregistrement à partir et à stimuler électriquement les cultures sur les AME.<em&gt; In vitro</em&gt; Les réseaux constituent un moyen de poser des questions pertinentes physiologiquement au niveau du réseau et des niveaux cellulaires conduisant à une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau et de dysfonctionnement.

Comment la culture, d&#39;enregistrement et stimuler les réseaux neuronaux sur les micro-électrodes Arrays (AME)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

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