Name: how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00
Duration: 9 min 27 s
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Wir möchten die Mitglieder des Potter-Gruppe für die Bereitstellung von wertvollen Kommentare über das Protokoll zu danken. ; Diese Arbeit wurde durch eine klinische Ausbildung durch Forschung Stipendium der American Academy of Neurology Foundation zu CMH, ein Stipendium des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS finanziert <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> zu JDR (GM08169) ), einen Zuschuss von der NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS054809), eine Ruth L. Kirschstein National Research Service Award für JDR (NS060392), ein NSF EFRI gewähren (0836017), der Coulter Foundation Translational Research Award, und eine translationale Forschung Stipendium für JDR (NS007480).

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	<li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies.">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li><li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+thick+brain+slices:+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability.">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task.">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li><li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+networks+of+cortical+neurons.">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li><li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks.">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li><li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings.">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li><li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks.">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li><li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+plasticity+in+cortical+assemblies.">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li><li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays:+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration.">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li><li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+(1-42)+peptide+concentrations.">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li><li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies.">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li><li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density:+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen.">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li><li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates.">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li><li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy.">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li><li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts.">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays,+with+real-time+control.">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li><li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks.">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li><li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures.">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting.">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks.">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation.">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li><li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons.">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li></ol>

CMH hat nichts zu offenbaren.<br /&gt; JDR und SMP sind Berater für Axion Biosystems bezahlt.<br /&gt; Die Einreichung Gebühren-und Videoverarbeitung Gebühren für diesen Artikel und Video wurden uns freundlicherweise von Multi-Channel Systems gesponsert.

Dieses Protokoll zeigt Anleitungen zur Kultur und zu pflegen neuronaler Netzwerke auf Mikroelektroden-Arrays sowie eine Einführung in die von der Aufnahme und anregende neuronale Netze. Einige der häufigsten Probleme bei der Aufnahme von MEAs wurden auch in der MEA Abschnitt zur Fehlerbehebung diskutiert. Es gibt gelegentliche Variationen in das Protokoll über diskutiert und oft sind diese Veränderungen genutzt werden, um spezifische Bedingungen durch bestimmte experimentelle Designs erforderlich zu optimieren. Obwohl die Aufnahme und anregenden hier vorgestellte System unserer maßgeschneiderten NeuroRighter 15 mit der MCS-Vorverstärker besteht, gibt es mehrere andere Systeme, die eine Schnittstelle mit der neuronalen Netze bieten kann. Die Auswahl einer bestimmten Einrichtung wird von der jeweiligen experimentellen Anforderungen ab. Simplistic Ableitung und Stimulation Beispiele wurden in diesem Protokoll vorgesehenen jedoch diese Kulturen auf MEAs verwendet werden, um Einblick in die komplexen Fragen rund um synaptische Aktivität und neuronale Netzwerk-Konnektivität zu liefern. Wie bereits erwähnt, die laufenden Arbeiten nutzt diese Technologie, um Prozesse wie zelluläre Plastizität Studie, Entwicklung, Exzitotoxizität und Neurodegeneration. 6-10 So zeigte eine aktuelle Publikation aus unserem Labor reproduzierbar zielgerichtet in vitro Lernen mit real-time Closed Loop Stimulation in Antwort auf aktuelle neuronales Netzwerk Aktivität 3. Obwohl MEA Kulturen sind oft heikel und delikat, dank ihrer Einfachheit und Zugänglichkeit (im Vergleich zu gesunden Tieren), bieten sie ein leistungsstarkes Modell zum Studium der neuronalen Aktivität in einem Netzwerk-Ebene.

Vorräte <ul><li> Einweg-Flasche top-Filter (150 ml, 0,2 um Porengröße; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embryonale Tag 18 timed-trächtigen Rattenweibchen </li><li> Mikroelektroden-Arrays (siehe Beschreibung im Protokoll, B1) </li><li> Mikroelektroden-Array Deckel (siehe Beschreibung im Protokoll, B3) </li><li> Nylon Zellsieb (40 um, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polypropylen konische Gefäße (steril, 15ml) </li><li> Polystyrol-Petrischalen (steril, 35 mm und 100x15mm) </li><li> Pipettenspitzen (steril, 20 &amp;mgr; l, 200 ul und 1000μl) </li><li> Serologische Pipetten (5 ml) </li></ul> Ausstattung: <ul><li> Biologische Sicherheitswerkbank / Laminarströmungshaube </li><li> Zellzähler </li><li> Zentrifuge </li><li> Container aus Eis </li><li> Präparierschere und Pinzette (sterilisiert) </li><li> Präpariermikroskop in einer Sterilbank </li><li> Handheld elektrische Pipetman </li><li> Hämazytometer </li><li> Isofluoran und Gaskammer </li><li> Lichtmikroskop </li><li> Handheld Pipetman (P-20 (20 &amp;mgr; l), P-200 (200 ul), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA Recording-System (siehe Beschreibung im Protokoll, D1) </li><li> Nager Guillotine </li><li> Tri-Gas-Inkubator (siehe Beschreibung in Protokoll, B15) </li><li> Thermosflasche mit Sauger in der Motorhaube befestigt </li><li> Wirbel </li><li> Wasserbad (35-37 ° C) </li></ul> Lösungen und Reagenzien: BSA-Lösung: Machen Sie 5% BSA (Sigma A-9418) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 und filtriert bei 0,2 um. Diese Lösung kann vor der Zeit vorbereitet werden und bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert. Zell-Medium: Kombinieren Sie 90 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml Pferdeserum (Gibco 16050), 1 ml Natriumpyruvat (100mm, Gibco 11360), 250 ul Glutamax (Gibco 35050) und Insulin (Endkonzentration 2,5 ug / ml, Sigma I-5500) dann durch eine 0,2 um filter.22 Warm passieren und ins Gleichgewicht der Zelle Medium in den Inkubator vor dem Gebrauch. Dissection Lösung für die Vorbereitung Papain-Lösung: 23 <table border="1"><tr><td> Dissection-Lösung (100ml Lager) </td><td> Kombinieren Sie in Ordnung, Filter 0,22 um und lagern bei 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Komponente </td><td> Inhalt ml </td><td> Endkonzentration (mM) </td></tr><tr><td> Doppelt destilliertem Wasser </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mM </td></tr><tr><td> 0,5 M HEPES </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% Phenolrot </td><td> 0,2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> 0,1 N NaOH </td><td> 0,2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M Kynurenic acid </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Diese Lösung kann vor der Zeit vorbereitet werden und bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert. DNAse I: Invitrogen (# 18047019). 50 ul Aliquots schockgefroren und bei -80 ° C gelagert Ein Aliquot wird in der Laminarströmungshaube vor Beginn der Zelle Dissoziation aufgetaut. Hanks balanced salt solution: Sigma (# 4891). A 1X-Lösung in entionisiertem Wasser hergestellt, sterilfiltriert bei 0,2 um und bei 4 ° C. Hibernate-Lösung: Bereiten Sie am Tag der Kultivierung. Kombinieren Sie 98 ml L-15-Medium (Invitrogen 11415) mit 2 ml B-27 Supplement (50X, Invitrogen # 17504) und Filter bei 0,2 um. Laminin-Lösung: Bereiten Sie am Tag der Kultivierung. Verdünnen Sie 20 &amp;mgr; l von Laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 ul Zellmedium für eine Endkonzentration von 0.02mg/ml. 20 pl-Aliquots der Laminin (1mg/ml) werden bei -80 ° C gelagert und unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut. Das Auftauen sollte auf der Tischplatte auftreten und nicht im Wasserbad so schnell auftauen kann manchmal zu einer Gelierung der Laminin führen. Papain-Lösung: 23 Warm 10 ml Dissektion Lösung (oben) auf 30-32 ° C. Add 200 Einheiten Papain (Sigma P-4762) und 1,6 mg L-Cystein (Sigma C-7880). Der pH-Wert auf 7,4 mit etwa 14 ul 0,1 N NaOH. Inkubieren für ca. 30 Minuten, bis die Lösung clOhren-, Filter 0,2 um, Flash-Freeze mit flüssigem Stickstoff in 2 ml Aliquots in 15 ml Polypropylen sterile konische Gefäße und bei -80 ° C. Tauwetter ein Aliquot bei 35-37 ° C vor dem Start-Protokoll. Polyethylenimin (PEI)-Lösung: 13 100 ul des PEI (50% w / v, Sigma P-3143) wird in 100 ml Natriumborat-Puffer (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) für eine endgültige Konzentration von 0,05% w / v. verdünnt Sterilfilter mit 0,2 um. Dies kann im Voraus zubereitet werden und bei 4 ° C über Monate. Sterile de-ionisiertes Wasser: Autoclave und lassen auf Raumtemperatur abkühlen vor zu bedienen. Trypsin (0,25% mit EDTA, Gibco 25200): 1ml Aliquots schockgefroren und bei -80 ° C gelagert Aliquots werden in die 35-37 ° C Wasserbad vor Gebrauch aufgetaut.

how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)

Für die letzten Jahrhunderts haben viele Neurowissenschaftler auf der ganzen Welt ihr Leben zu verstehen, wie neuronale Netzwerke gewidmet und warum sie stoppen bei verschiedenen Krankheiten arbeiten. Studien haben neuropathologischen Beobachtung, Fluoreszenzmikroskopie mit genetischen Kennzeichnung und intrazelluläre Aufnahme in beiden dissoziierten Neuronen und in Scheiben schneiden Vorbereitungen einbezogen. Dieses Protokoll beschreibt eine andere Technologie, die wachsende dissoziierten neuronalen Kulturen auf Micro-Elektroden Arrays (auch als Multi-Elektroden-Arrays, MEAs) beinhaltet. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung dieses Systems gegenüber anderen Technologien. Dissoziierten neuronalen Kulturen auf MEAs bieten ein vereinfachtes Modell, in dem Netzwerk-Aktivität mit elektrischer Stimulation Sequenzen durch die Arrays mehrere Elektroden manipuliert werden können. Da das Netzwerk klein ist, ist die Wirkung der Stimulation auf beobachtbare Bereiche, die nicht der Fall ist in der intakten Präparate begrenzt. Die Zellen wachsen in einer Monoschicht Änderungen in der Morphologie leicht mit verschiedenen bildgebenden Verfahren zu überwachen. Schließlich können Kulturen auf MEAs über ein Jahr lang in vitro, die eine klare zeitliche Beschränkungen, die mit anderen Kultivierungsmethoden entfernt überleben. 1 Unser Labor und andere rund um den Globus nutzen diese Technologie, um wichtige Fragen zu neuronalen Netzen zu fragen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs bieten. In-vitro-Netzwerke bieten eine Möglichkeit für Fragen physiologisch relevanten Fragen bei der Netzwerk-und zellulärer Ebene, was zu einem besseren Verständnis der Gehirn Funktion und Dysfunktion.

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How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Dieses Protokoll liefert die notwendigen Informationen für den Aufbau, die Pflege, die Aufnahme von und elektrisch stimuliert Kulturen auf MEAs.<em&gt; In-vitro-</em&gt; Netzwerke bieten eine Möglichkeit für Fragen physiologisch relevanten Fragen bei der Netzwerk-und zellulärer Ebene führt zu einem besseren Verständnis der Hirnfunktion und Dysfunktion.

Wie Kultur, Record und stimulieren Neuronale Netze auf Micro-Elektroden Arrays (MEAs)

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

Research

JoVE Journal

Biology

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

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