Name: how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00
Duration: 9 min 27 s
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Vorremmo ringraziare i membri del gruppo di Potter per fornire preziosi commenti sul protocollo. Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio clinico di formazione alla ricerca presso l&#39;Accademia Americana di Neurologia della Fondazione a CMH, una borsa di studio presso l&#39;Istituto Nazionale di General Medical Sciences (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) a JDR (GM08169 ), una borsa di studio del National Institute of NIH Neurological Disorder and Stroke (NS054809), un Ruth L. Kirschstein Nazionale Servizio Research Award per JDR (NS060392), un NSF Efri borsa (0.836.017), il Premio Fondazione per la Ricerca Traslazionale Coulter, e un borsa di studio di ricerca traslazionale per JDR (NS007480).

<ol>
	<li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies.">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li><li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+thick+brain+slices:+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability.">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task.">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li><li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+networks+of+cortical+neurons.">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li><li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks.">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li><li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings.">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li><li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks.">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li><li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+plasticity+in+cortical+assemblies.">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li><li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays:+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration.">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li><li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+(1-42)+peptide+concentrations.">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li><li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies.">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li><li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density:+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen.">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li><li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates.">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li><li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy.">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li><li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts.">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays,+with+real-time+control.">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li><li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks.">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li><li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures.">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting.">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks.">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation.">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li><li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons.">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li></ol>

CMH non ha nulla da rivelare.<br /&gt; JDR e SMP sono pagati consulenti per Axion Biosystems.<br /&gt; Le tasse di presentazione e le spese di elaborazione video per questo articolo e il video sono stati gentilmente sponsorizzato da sistemi multi-canale.

Questo protocollo mostra le istruzioni su come la cultura e mantenere reti neuronali su micro-array di elettrodi e come introduzione alla registrazione da reti neuronali e stimolante. Alcuni dei problemi più comuni quando si registra da MEA sono stati discussi anche nella sezione MEA risoluzione dei problemi. Ci sono variazioni occasionali nel protocollo come discusso in tutto e spesso questi cambiamenti sono utilizzati per ottimizzare le condizioni specifiche richieste da parte di alcuni progetti sperimentali. Anche se il sistema di registrazione e stimolante qui presentata è composta della nostra progettato NeuroRighter 15 con il preamplificatore MCS, ci sono più altri sistemi in grado di fornire una interfaccia con le reti neuronali. La scelta di un particolare impostazione dipenderà dalle specifiche esigenze sperimentali. Registrazione semplicistica e stimolazione esempi sono stati forniti in questo protocollo tuttavia queste culture su MEA possono essere utilizzati per fornire indicazioni su questioni complesse attività sinaptica e la connettività di rete neuronale. Come accennato in precedenza, i lavori in corso sta utilizzando questa tecnologia per studiare processi come la plasticità cellulare, lo sviluppo, eccitotossicità e neurodegenerazione. 6-10 Ad esempio, una recente pubblicazione dal nostro laboratorio hanno mostrato obiettivo riproducibile regia di apprendimento in vitro in tempo reale la stimolazione a circuito chiuso in risposta alle attuali attività di rete neuronale 3. Anche se le culture MEA sono spesso schizzinosi e delicati, grazie alla loro semplicità e accessibilità (rispetto agli animali intatti), forniscono un potente modello per studiare l&#39;attività neuronale a livello di rete.

Forniture <ul><li> Monouso per bottiglie filtro (150ml, 0.2μm dimensione dei pori; Nalgene # 565-0020) </li><li> Embrionale giorno 18 tempo gravide di ratto femmina </li><li> Array di microelettrodi (vedi descrizione nel protocollo, B1) </li><li> Microelettrodo coperchi array (vedi descrizione nel protocollo, B3) </li><li> Nylon cellule filtro (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Provette coniche in polipropilene (sterile, 15 ml) </li><li> Polistirolo piastre di Petri (sterile, 35mm e 100x15mm) </li><li> Puntali (sterile, 20μl, 200μl e 1000μl) </li><li> Pipette sierologiche (5ml) </li></ul> Attrezzatura: <ul><li> Biologici di sicurezza armadio / cappa a flusso laminare </li><li> Contatore di cellule </li><li> Centrifuga </li><li> Contenitore di ghiaccio </li><li> Dissezione forbici e pinze (sterilizzato) </li><li> Dissezione microscopio in una cappa a flusso laminare </li><li> Portatile elettrico Pipetman </li><li> Emocitometro </li><li> Isofluorane e delle camere a gas </li><li> Microscopio ottico </li><li> Pipetman palmare (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA sistema di registrazione (vedi descrizione nel protocollo, D1) </li><li> Roditori Ghigliottina </li><li> Tri-incubatore di gas (vedi descrizione nel protocollo, B15) </li><li> Fiasco vuoto con aspiratore collegato al cofano </li><li> Vortice </li><li> Acqua del bagno (35-37 ° C) </li></ul> Soluzioni e reagenti: BSA soluzione: Fare 5% di BSA (Sigma A-9418) in tampone fosfato salino a pH 7,4 e filtrata a 0.2μm. Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservato a 4 ° C per diversi mesi. Cell Media: Unire 90 ml Dulbecco modificato Eagle medio (Irvine Scientific 9024), 10 ml di siero di cavallo (Gibco 16.050), il piruvato di sodio 1 ml (100mM, Gibco 11.360), 250 microlitri GlutaMAX (Gibco 35.050), e l&#39;insulina (concentrazione finale di 2,5 mcg / ml, sigma I-5500) poi passare attraverso un 0,2 micron filter.22 Caldo ed equilibrare il medium delle cellule nell&#39;incubatore prima dell&#39;uso. Soluzione dissezione per la preparazione della soluzione papaina: 23 <table border="1"><tr><td> Dissezione soluzione (100 ml stock) </td><td> Combina in ordine, filtro 0,22 micron e conservare a 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Componente </td><td> Ml di volume </td><td> Concentrazione finale (mM) </td></tr><tr><td> Acqua bidistillata </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mm </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mm </td></tr><tr><td> 0,5 M HEPES </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mm </td></tr><tr><td> 0,5% rosso fenolo </td><td> 0,2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> 0,1 N NaOH </td><td> 0,2 </td><td> 0,2 mm </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mm </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M Kynurenic acido </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0,05 mm </td></tr></table> Questa soluzione può essere preparata in anticipo e conservato a 4 ° C per diversi mesi. DNAsi I: Invitrogen (# 18047019). Aliquote di 50μl sono istantaneamente congelati e conservati a -80 ° C. Un&#39;aliquota viene scongelato in cappa a flusso laminare prima di iniziare il processo di dissociazione delle cellule. Sale di Hank soluzione equilibrata: Sigma (# 4891). Una soluzione 1X viene preparato in acqua deionizzata, sterile filtrata a 0.2μm e conservato a 4 ° C. Hibernate soluzione: Preparare il giorno di coltura. Unire 98 ml L-15 di media (Invitrogen 11.415) con 2 ml di B-27 supplemento (50X, Invitrogen # 17504) e filtro a 0,2 micron. Laminina soluzione: Preparare il giorno di coltura. Diluire 20μl di laminina (1mg/ml, Sigma L-2020) nel 980 microlitri di cellule medio per una concentrazione finale di 0.02mg/ml. Aliquote da 20 microlitri della laminina (1mg/ml) sono conservati a -80 ° C e scongelati al momento dell&#39;uso. Scongelamento deve avvenire sul banco e non nel bagno d&#39;acqua come un rapido disgelo a volte può portare a gelificazione della laminina. Papaina soluzione: 23 Calda 10 ml di soluzione di dissezione (sopra) a 30-32 ° C. Aggiungere 200 unità papaina (Sigma P-4762) e 1,6 mg L-cisteina (Sigma C-7880). Regolare il pH a 7,4 con circa 14 ml di 0,1 N NaOH. Incubare per circa 30 minuti fino a quando la soluzione clorecchie, filtro 0,2 micron, congelare flash con azoto liquido a 2 ml in 15 ml di polipropilene fiale sterili conica e conservare a -80 ° C. Scongelare una aliquota a 35-37 ° C prima di iniziare il protocollo. Polyethyleneimine (PEI) soluzione: 13 100 l di PEI (50% w / v, Sigma P-3143) viene diluito in 100 ml di tampone borato di sodio (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) per una concentrazione finale di 0,05% w / v. Filtro sterile a 0,2 micron. Questo può essere preparato in anticipo e conservato a 4 ° C per mesi. Sterile acqua deionizzata: Autoclave e lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Tripsina (0,25% con EDTA, Gibco 25200): Aliquote da 1 ml sono istantaneamente congelati e conservati a -80 ° C. Aliquote sono scongelati nel I ° 35-37 bagnomaria C prima dell&#39;uso.

how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)

Per tutto il secolo scorso, i neuroscienziati di tutto il mondo hanno dedicato la loro vita per comprendere come le reti neurali funzionano e perché smettere di lavorare in varie malattie. Gli studi hanno incluso l&#39;osservazione neuropatologici, la microscopia a fluorescenza con etichettatura genetica, e la registrazione intracellulare nei neuroni sia dissociato e preparati fetta. Questo protocollo descrive un&#39;altra tecnologia, che coinvolge sempre più dissociato culture neuronali su micro-array di elettrodi (detti anche multi-array di elettrodi, MEA). Ci sono molteplici vantaggi di utilizzare questo sistema rispetto ad altre tecnologie. Dissociato culture neuronali su tali accordi forniscono un modello semplificato, in cui l&#39;attività di rete può essere manipolato con sequenze di stimolazione elettrica attraverso elettrodi multipli dell&#39;array. Perché la rete è piccola, l&#39;effetto della stimolazione è limitata ad aree osservabile, che non è il caso di preparati intatto. Le cellule crescono in un monostrato apportare modifiche nella morfologia facile da monitorare con varie tecniche di imaging. Infine, le culture su MEA può sopravvivere per oltre un anno in vitro che rimuove le limitazioni di tempo chiaro inerenti alle tecniche di coltura di altri 1. Il nostro laboratorio e altri in tutto il mondo stanno utilizzando questa tecnologia di porre domande importanti su reti neuronali. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire le informazioni necessarie per l&#39;impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture in AAM. Nelle reti in vitro forniscono un mezzo per porre fisiologicamente questioni rilevanti a livello di rete e livello cellulare che porta ad una migliore comprensione di funzione e disfunzione cerebrale.

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How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per l&#39;impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture su MEA.<em&gt; In vitro</em&gt; Le reti forniscono un mezzo per porre fisiologicamente questioni rilevanti a livello di rete e livello cellulare che porta ad una migliore comprensione della funzione cerebrale e la disfunzione.

Come la cultura, record e stimolare reti neuronali sulla micro-array di elettrodi (MEA)

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