Name: how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00
Duration: 9 min 27 s
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Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo Potter para fornecer observações inestimáveis ​​sobre o protocolo. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação clínica de treinamento da Academia Americana de Neurologia da Fundação para CMH, uma bolsa de estudos do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS; <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> ) para JDR (GM08169 ), uma concessão do National Institute of NIH Distúrbios Neurológicos e Derrame (NS054809), uma Ruth L. Kirschstein Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa de JDR (NS060392), um NSF Efri subvenção (0.836.017), a Fundação Coulter Prêmio de Pesquisa Translacional, e um bolsa de pesquisa translacional para JDR (NS007480).

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	<li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies.">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li><li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+thick+brain+slices:+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability.">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task.">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li><li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+networks+of+cortical+neurons.">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li><li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks.">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li><li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings.">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li><li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks.">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li><li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+plasticity+in+cortical+assemblies.">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li><li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays:+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration.">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li><li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+(1-42)+peptide+concentrations.">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li><li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies.">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li><li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density:+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen.">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li><li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates.">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li><li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy.">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li><li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts.">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays,+with+real-time+control.">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li><li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks.">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li><li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures.">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li><li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting.">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li><li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks.">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation.">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li><li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons.">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells. , (1998).</li></ol>

CMH não tem nada a revelar.<br /&gt; JDR e SMP são pagos consultores para Axion Biosystems.<br /&gt; As taxas de envio e taxas de processamento de vídeo para este artigo e vídeo foram gentilmente patrocinado pela Multi-Channel Systems.

Este protocolo apresenta instruções sobre como a cultura e manter redes neuronais em micro-eletrodo de matrizes, bem como uma introdução para a gravação de redes neuronais e estimulante. Alguns dos problemas mais comuns durante a gravação de MEAs também foram discutidos na seção de solução MEA. Existem variações ocasionais no protocolo como discutido ao longo e muitas vezes essas mudanças são utilizados para otimizar as condições específicas exigidas por alguns projetos experimentais. Embora o sistema de gravação e estimular aqui apresentada é composta por nossa personalizados NeuroRighter 15 com o pré-amplificador MCS, existem vários outros sistemas que podem fornecer uma interface com as redes neuronais. Escolher uma configuração particular dependerá das necessidades específicas experimental. Gravação simplista e exemplos de estimulação foram fornecidas neste protocolo no entanto essas culturas em MEAs pode ser usado para fornecer informações sobre questões complexas sobre a atividade sináptica e conectividade de rede neuronal. Como mencionado acima, o trabalho em curso está utilizando esta tecnologia para estudar processos como plasticidade celular, excitotoxicidade, desenvolvimento e neurodegeneração. 60-10 Por exemplo, uma publicação recente de nosso laboratório mostraram reprodutíveis objetivo dirigido aprendizagem in vitro com real-tempo de estimulação de malha fechada em resposta à atividade neuronal rede atual 3. Embora a cultura MEA são muitas vezes finicky e delicado, graças à sua simplicidade e acessibilidade (em comparação com animais intactos), eles oferecem um modelo poderoso para estudar a atividade neuronal em um nível de rede.

Abastecimento <ul><li> Descartáveis ​​garrafa superior do filtro (150ml, tamanho dos poros 0,2 Hm; Nalgene # 565-0020) </li><li> Dia embrionário 18 ratos timed-fêmea grávida </li><li> Matrizes de microeletrodos (ver descrição no protocolo, B1) </li><li> Microeletrodo tampas array (ver descrição no protocolo, B3) </li><li> Nylon célula filtro (40μm, BD Falcon, # 352340) </li><li> Polipropileno cônico frascos (estéril, 15ml) </li><li> Placas de Petri de poliestireno (estéril, de 35mm e 100x15mm) </li><li> Pontas de pipeta (estéril, 20μl, 200μl e 1000μl) </li><li> Pipetas sorológicas (5ml) </li></ul> Equipamento: <ul><li> Biológicos de segurança capela de fluxo gabinete / laminar </li><li> Contador de células </li><li> Centrifugador </li><li> Recipiente de gelo </li><li> Tesouras de dissecação e pinça (esterilizada) </li><li> Dissecando microscópio em uma capela de fluxo laminar </li><li> Handheld elétrica Pipetman </li><li> Hemocitômetro </li><li> Isofluorano e câmaras de gás </li><li> Microscópio de luz </li><li> Handheld Pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) </li><li> MEA sistema de gravação (ver descrição no protocolo, D1) </li><li> Guilhotina roedores </li><li> Tri-gás incubadora (ver descrição no protocolo, B15) </li><li> Balão de vácuo, com aspirador ligado na capa </li><li> Vórtice </li><li> Banho-maria (35-37 ° C) </li></ul> Soluções e Reagentes: Solução BSA: Faça BSA 5% (Sigma A-9418) em tampão fosfato salina pH 7,4 e filtrado a 0,2 Hm. Esta solução pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C durante vários meses. Médio célula: Combine 90 meio modificado ml Dulbecco Águia (Irvine Scientific 9024), 10 ml soro de cavalo (Gibco 16.050), piruvato de sódio 1 ml (100mM, Gibco 11.360), 250 Glutamax mL (Gibco 35.050) e insulina (concentração final 2,5 mg / ml, Sigma I-5500), em seguida, passar por um 0,2 mM Quente filter.22 e equilibrar o meio de células na incubadora antes de usar. Solução de dissecção para a preparação de solução papaína: 23 <table border="1"><tr><td> Solução de dissecção (100ml estoque) </td><td> Combine em ordem, 0,22 mM filtrar e armazenar a 4 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> Componente </td><td> Ml de volume </td><td> Concentração Final (mM) </td></tr><tr><td> Água bidestilada </td><td> 91,175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0,58 </td><td> 5,8 mM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0,025 </td><td> 0,25 mM </td></tr><tr><td> HEPES 0,5 M </td><td> 0,32 </td><td> 1,6 mM </td></tr><tr><td> 0,5% de vermelho de fenol </td><td> 0,2 </td><td> (0,001%) </td></tr><tr><td> NaOH 0,1 N </td><td> 0,2 </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4,5 </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3,0 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> 0,1 M ácido cinurênico </td><td> 1,0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> 5 mM APV </td><td> 1,0 </td><td> 0,05 mM </td></tr></table> Esta solução pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C durante vários meses. DNAse I: Invitrogen (# 18047019). 50μl alíquotas são de flash congeladas e armazenadas a -80 ° C. Uma alíquota é descongelado no capela de fluxo laminar antes de iniciar o processo de dissociação das células. Solução salina balanceada de Hank: Sigma (# 4891). Uma solução de 1X é preparada em água deionizada estéril, filtrada em 0,2 Hm e armazenados a 4 ° C. Solução Hibernate: Prepare no dia da cultura. Combine 98 ml de meio L-15 (Invitrogen 11415), com 2 ml suplemento B-27 (50X, Invitrogen # 17504) e filtro de 0,2 mm. Solução laminina: Prepare no dia da cultura. Diluir 20μl de laminina (1mg/ml, Sigma L-2020) em 980 mL meio de células para uma concentração final de 0.02mg/ml. 20 alíquotas mL da laminina (1mg/ml) são armazenadas a -80 ° C e descongeladas imediatamente antes de usar. Descongelamento deve ocorrer na bancada e não no banho de água como o rápido degelo pode levar a gelificação da laminina. Papaína solução: 23 10 ml de solução quente dissecção (acima) para 30-32 ° C. Adicionar 200 unidades papaína (Sigma P-4762) e 1,6 mg L-cisteína (Sigma C-7880). Ajustar o pH para 7,4 com cerca de 14 mL de 0,1 N NaOH. Incubar por cerca de 30 minutos até que o cl soluçãoorelhas, filtro de 0,2 mm, flash freeze com nitrogênio líquido, em alíquotas de 2 ml em 15 ml de polipropileno estéril frascos cônicos e armazenar a -80 ° C. Descongelar uma alíquota a 35-37 ° C antes de iniciar o protocolo. Polietilenoimina solução (PEI): 13 100 ul de PEI (50% w / v, Sigma P-3143) é diluído em 100 ml tampão borato de sódio (0,1 M pH 8,4, Sigma B-9876) para uma concentração final de 0,05% w / v. Filtro estéril de 0,2 mm. Isto pode ser preparado com antecedência e armazenado a 4 ° C durante meses. Água deionizada estéril: Autoclave e deixar arrefecer à temperatura ambiente antes de usar. Tripsina (0,25% com EDTA, Gibco 25200): Alíquotas de 1ml de flash são congeladas e armazenadas a -80 ° C. Alíquotas são descongelados em banho-maria a 35-37 ° C antes do uso.

how to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (meas)

Para o século passado, muitos neurocientistas de todo o mundo têm dedicado suas vidas para entender como as redes neuronais funcionam e por que parar de trabalhar em várias doenças. Estudos incluíram observação neuropatológicos, microscopia fluorescente com rotulagem genética, e gravação intracelular em ambos os neurônios dissociados e preparações fatia. Este protocolo discute outra tecnologia, que envolve o crescimento neuronal em culturas dissociadas micro-eletrodo arrays (também chamado de multi-eletrodo arrays, AAM). Há múltiplas vantagens de usar este sistema através de outras tecnologias. Dissociada culturas neuronal em MEAs fornecer um modelo simplificado em que a atividade de rede podem ser manipulados com sequências de estimulação elétrica através de eletrodos múltiplos da matriz. Porque a rede é pequena, o impacto da estimulação é limitada a áreas observáveis, o que não é o caso de preparações intactas. As células crescem em uma monocamada fazer alterações na morfologia fácil de monitorar, com várias técnicas de imagem. Finalmente, as culturas em MEAs pode sobreviver por mais de um ano in vitro que remove todas as limitações inerentes de tempo claro com as técnicas de cultivo outras 1. Nosso laboratório e outros em todo o mundo estão utilizando esta tecnologia para fazer perguntas importantes sobre redes neuronais. O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas em MEAs. Em redes vitro fornecer um meio para pedir fisiologicamente questões relevantes na rede e níveis celulares levando a uma melhor compreensão da função cerebral e disfunção.

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How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays MEAs

Este protocolo fornece as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas na AAM.<em&gt; In vitro</em&gt; Redes de fornecer um meio para pedir fisiologicamente questões relevantes na rede e níveis celulares levando a uma melhor compreensão da função cerebral e disfunção.

Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

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